[發明專利]用于DNA斷裂和標記的固定化的轉座酶復合體

有效

• 申請號: 201310459721.4
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103710323B
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: A.S.貝爾耶夫
• 申請（專利權）人: 安捷倫科技有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 封新琴

本發明提供了用于制備高度適用于斷裂DNA的純化的轉座酶復合體的簡單和迅速的方法。所述方法包括在細胞裂解物中形成轉座酶與寡核苷酸銜接子的復合體，然后從所述細胞裂解物中的其它物質中將該復合體純化出來。純化使用特異性結合對完成，其中所述對的一個成員結合于復合物的寡核苷酸銜接子，而所述對的另一個成員結合于固體基質。結合的復合體可以立即在DNA斷裂反應中使用以產生結合于固體基質的DNA片段，后者可以用于任意目的，包括用作擴增和測序的模板。

對相關申請的交叉引用

本申請依賴在2012年10月1日提交的美國臨時專利申請號61/708,332的提交日并要求其的權益，通過提述將該文獻的全部公開內容并入本文。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域。更加具體地，本發明涉及具有轉座酶的組合物，所述轉座酶通過特異性結合對（specific binding pair）聯接的方式在粗制細胞裂解物中與寡核苷酸銜接子(adapter)復合或結合至固體支持物，本發明還涉及所述轉座酶/寡核苷酸復合體在該復合體的純化中的用途，以及所述復合體用于制備體外擴增用的DNA分子、核酸分子測序、以及在DNA文庫中篩選感興趣的序列的用途。

背景技術

基因組DNA的斷裂是高通量測序的DNA樣品制備中的關鍵步驟，高通量測序也稱為下一代測序(next generation sequencing)或NGS。原來使用的樣品制備方法，如使用DNA酶I的DNA斷裂，非常不可靠，且經常導致DNA斷裂不足或過度。在兩種情況中，有用大小（大約200-800堿基對（bp））的DNA片段的產率都是較低的。使用超聲破碎儀（sonicator）的DNA剪切法提供了另外的選擇，超聲破碎儀的例子有來自Covaris(Woburn,MA)的E220和E220x儀器。然而，這類儀器非常昂貴（2012年價格超過100,000美元）且整個DNA剪切法是勞動密集和多步驟的過程。其牽涉DNA斷裂、片段末端修復（fragments ends repair）、第一片段純化（first fragments purification）、加poly-A尾（poly-A tailing）、銜接子連接（adapter ligation）、第二片段純化（second fragments purification）、PCR擴增（PCRamplification）、以及第三片段純化（third fragments purification）。使用寡核苷酸-轉座酶復合體，如來自Illumina(San Diego,CA)的NEXTERA^TMDNA樣品制備試劑盒，可以將數個步驟省去一半。試劑盒所提供的寡核苷酸-轉座酶復合體可以在一個反應中既實現受控的DNA斷裂，又實現銜接子的連接，該反應僅需要幾分鐘。這類復合體包括一個修飾的Tn5轉座酶二聚體和一對Tn5-結合性雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）寡核苷酸，所述寡核苷酸含有19bp的轉座酶結合序列，或反向重復序列（inverted repeat sequence，IR）。在NEXTERA^TM系統中，使用一種工程改造的、非天然的19bp轉座酶結合序列，其提供了比天然Tn5IR序列更加有效的DNA斷裂。這種結合序列稱為“鑲嵌體（mosaic）”。

不像DNA酶那樣單個分子就能在靶DNA中產生多處斷裂，轉座酶復合體據信每個復合體只產生一個DNA斷裂。因此和DNA酶I不同的是，通過控制反應混合物中轉座酶復合體與靶DNA的比例，在轉座酶斷裂期間DNA斷裂的程度是容易控制的。而且，在這種轉座酶介導的DNA斷裂過程中可以附接上與所述鑲嵌體序列組合的特異性核苷酸標簽，這對于PCR中的DNA擴增和將DNA片段附加至測序芯片是有用的。盡管在成本、時間和勞力方面有明顯的優勢，但轉座酶方法不如超聲破碎法使用得頻繁，因為它所導致的靶DNA的斷裂不是完全隨機的（偏倚（bias））。