[發(fā)明專利]檢測IDH1、IDH2基因多態(tài)突變位點(diǎn)的引物、方法和試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310459219.3
• 申請(qǐng)日: 2013-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN103451314A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周曉犢;王淑一
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州裕陽專利事務(wù)所(普通合伙) 33221
• 代理人: 應(yīng)圣義

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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及檢測IDH1、IDH2基因多態(tài)突變熱點(diǎn)的引物，采用普通PCR技術(shù)，可用于快速檢測急性粒細(xì)胞白血病（AML）患者體內(nèi)IDH1、IDH2基因多態(tài)位點(diǎn)的突變情況。?

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背景技術(shù)

造血組細(xì)胞的獲得性遺傳和表觀遺傳學(xué)的改變是急性髓系白血病（AML）的發(fā)病因素之一，這些變化改變了造血組細(xì)胞的生長、增殖和分化的正常機(jī)制。AML發(fā)病時(shí)骨髓原始細(xì)胞隱藏著一種或以上的染色體變異，這些變異不僅是AML的診斷標(biāo)志，更是評(píng)價(jià)完全緩解率(CR)，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（RR）)及總生存(OS)的指標(biāo)。然而，國外資料表明，AML的染色體核型異常檢出率為60-80%。因此，仍有一大部分AML患者沒有發(fā)現(xiàn)染色體變異，這組患者所患的疾病為核型正常的AML?(CN-AML)，是AML中占比例最多的亞型，按細(xì)胞遺傳學(xué)分析，它們歸為預(yù)后中等組。?

異檸檬酸脫氫酶(IDH)家族包括以NAD或NADP為輔助因子，催化異檸檬酸的氧化脫酸反應(yīng)生成α-酮戊二酸的酶類，同時(shí)分別生成NADH或NADPH。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，IDH同工酶有以下三種形式：依賴NAD的線粒體IDH，依賴NADP的線粒體IDH，依賴NADP的胞質(zhì)IDH。編碼依賴NADP的人IDH?1酶的IDH?1基因位于染色體2q33.3，并且定位于細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體中；編碼依賴NADP的線粒體IDH2酶的IDH2基因位于染色體15q26.1。盡管IDH1和IDH2都參與了細(xì)胞內(nèi)氧化損傷的防御機(jī)制，但I(xiàn)DH1在脂質(zhì)的代謝機(jī)制中起了重要作用。?

?近年來，更多的研究發(fā)現(xiàn)，IDH1和IDH2突變存在于急性髓系白血病（AML）、急性淋巴性白血病（ALL）、骨髓增殖性疾病（MPD）中，在慢性粒細(xì)胞白血病(CML)中尚未檢測到突變。文獻(xiàn)報(bào)道IDH?1和IDH2熱點(diǎn)突變?cè)贑N-AML患者中的發(fā)生率分別為5.5-9.6%和3-11%，并認(rèn)為具有IDH?1和IDH2熱點(diǎn)突變的AML患者具有較低的CR，較高的RR和較短的OS。目前對(duì)于IDH1和IDH2的檢測主要采用全外顯子測序的方法，該方法流程繁瑣和檢測費(fèi)用高。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測IDH1、IDH2基因多態(tài)突變熱點(diǎn)的引物，采用PCR技術(shù)，可用于快速檢測急性粒細(xì)胞白血病（AML）患者體內(nèi)IDH1、IDH2基因多態(tài)位點(diǎn)的突變情況。所述檢測IDH1、IDH2基因多態(tài)熱點(diǎn)突變情況的引物，其特征在于，包括：?

(ⅰ)?擴(kuò)增IDH1基因的引物，其堿基序列為：

IDH1-132-F：?GATGAGAAGAGGGTTGAGGA（SEQ?NO1）

IDH1-132-R：?GTTGGAAATTTCTGGGCCAT（SEQ?NO2）

?(ⅱ)?擴(kuò)增IDH2基因的引物，其堿基序列為：

?????IDH2-140/172-F：?CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT（SEQ?NO3）

IDH2-140/172-R：?CAAGAGGATGGCTAGGCGAG（SEQ?NO4）。

進(jìn)一步地，還包括測序引物，其堿基序列為：?

(ⅰ)?檢測IDH1基因的測序引物堿基序列為：

IDH1-132-F：?GATGAGAAGAGGGTTGAGGA（SEQ?NO1）

IDH1-132-R：?GTTGGAAATTTCTGGGCCAT（SEQ?NO2）

?(ⅱ)?檢測IDH2基因的測序序列的引物堿基序列為：

?????IDH2-140/172-F：?CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT（SEQ?NO3）

IDH2-140/172-R：?CAAGAGGATGGCTAGGCGAG（SEQ?NO4）。

進(jìn)一步地，引物序列IDH1-132-F和IDH1-132-R是擴(kuò)增IDH1基因包含第132位氨基酸序列的引物。?

進(jìn)一步地，引物序列IDH2-140/172-F和IDH2-140/172-R是擴(kuò)增擴(kuò)增IDH2基因包含第140、第172位氨基酸序列的引物。?

本發(fā)明還提供了檢測IDH1、IDH2基因多態(tài)熱點(diǎn)突變情況的方法，包括以下步驟：?

1.抽提血液中的組織DNA；

2.用PCR擴(kuò)增步驟1中提取的DNA；

3.對(duì)步驟2中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序；

4.對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行判斷，確定IDH1、IDH2基因是否發(fā)生突變；

其中PCR擴(kuò)增引物為：