[發明專利]檢測DNMT3A突變位點的方法、引物和試劑盒

有效

• 申請號: 201310459210.2
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103540659A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 周曉犢;李文靜;王淑一
• 申請（專利權）人: 武漢艾迪康醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州裕陽專利事務所(普通合伙) 33221
• 代理人: 應圣義

???

技術領域

本發明屬生命科學和生物技術領域，涉及檢測DNMT3A第882位多態性突變的方法、引物和試劑盒。采用普通PCR技術進行擴增，再進行測序，就可確定檢測急性粒細胞白血病（AML）患者體內DNMT3A?第882位多態性突變情況。

?

背景技術

急性髓細胞白血病(acute?myeloid?leukemia，AML)是一類由造血祖細胞分化受阻及增殖異常而導致的血液系統惡性腫瘤，近年來在AML中鑒定出了多種有重要預后價值的分子標記，由基因突變導致的細胞增殖、分化和細胞凋亡途徑的改變是AML的發病基礎。其中，新近的研究熱點DNA甲基轉移酶3A基因(DNA-methyltransferase?3?alpha，DNMT3A)編碼DNA甲基轉移酶3A，在DNA甲基化過程中起催化作用，而現今普遍認為DNA的甲基化水平與腫瘤的發生高度相關。DNMT3A基因的突變在AML患者中高達20%，經大量臨床隨訪研究提示該基因發生突變與預后不良相關聯。它的突變形式也多種多樣，熱點突變是發生于編碼第第882位精氨酸的基因位點的錯義突變，突變類型為R882位精氨酸變為組氨酸(R882H)、半胱氨酸(R882C)，脯氨酸(R882P)、絲氨酸(R882S)。

DNMT3A?突變已成為新的預后指標，有助于臨床醫師早期識別正常核型AML患者中的不同亞型，以便盡早地對患者進行有效治療。

?

發明內容

本發明的目的是提供檢測DNMT3A第882位多態性突變的方法、引物和試劑盒。采用普通PCR技術進行擴增，再進行測序，就可確定檢測急性粒細胞白血病（AML）患者體內DNMT3A?第882位多態性突變情況。

本發明提供檢測樣品DNMT3A第882位多態性突變的引物，所述引物包括一對擴增引物，其堿基序列為：

DNMT3A?882-F:?TTCGGCAGAACTAAGCAG(SEQ?ID?NO.1)

DNMT3A?882-R:?GTCCCTTACACACACGCA(SEQ?ID?NO.2)。

進一步地，所述引物還一對測序引物，其堿基序列為：

DNMT3A?882-F:?TTCGGCAGAACTAAGCAG

DNMT3A?882-R:?GTCCCTTACACACACGCA。

進一步地，所述多態性突變選自R882H、R882C、?R882P和R882S。

本發明還提供一種檢測樣品DNMT3A第882位多態性突變的方法，所述方法包括：

(1)提取樣品中的基因組DNA；

(2)利用一對擴增引物對(1)中的DNA進行擴增，獲得擴增產物；

(3)利用一對測序引物對(2)中的擴增產物進行測序，獲得所述擴增產物的基因序列；

(4)將(3)中的基因序列與DNMT3A野生型基因序列進行比較，確定所述多態性突變是否存在，其中

所述的一對擴增引物，其堿基序列為：

DNMT3A?882-F:?TTCGGCAGAACTAAGCAG

DNMT3A?882-R:?GTCCCTTACACACACGCA?

所述的一對測序引物，其堿基序列為：

DNMT3A?882-F:?TTCGGCAGAACTAAGCAG

DNMT3A?882-R:?GTCCCTTACACACACGCA?

本發明還提供一種檢測樣品DNMT3A第882位多態性突變的試劑盒，所述試劑盒包括樣品基因組DNA抽提試劑；無水乙醇；檢測體系PCR反應液、測序體系反應液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。

進一步地，所述檢測體系PCR反應液包括dNTPs、KOD?FX?DNA?Polymerase和一對擴增引物DNMT3A882-F和DNMT3A882-R，其中

DNMT3A?882-F:?TTCGGCAGAACTAAGCAG

DNMT3A?882-R:?GTCCCTTACACACACGCA?

進一步地，所述測序體系反應液包括測序純化反應液、EDTA、無水乙醇、75%乙醇、HIDI和一對測序引物DNMT3A882-F和DNMT3A882-R，其中

DNMT3A?882-F:?TTCGGCAGAACTAAGCAG

DNMT3A?882-R:?GTCCCTTACACACACGCA?