[發(fā)明專利]檢測人XPD基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的方法、引物和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310457040.4
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103540658A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 薛群;李文靜;王淑一;徐建成
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州裕陽專利事務(wù)所(普通合伙) 33221
• 代理人: 應(yīng)圣義

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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及用于檢測人著色性干皮病D組?(xeroderma?pigmentosum?group?D，XPD)?基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)（Lys751Gln）的方法、引物和試劑盒，能夠?qū)PD基因突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，特異性好，準(zhǔn)確度高，可提高突變檢出率。

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背景技術(shù)

人著色性干皮病D組?(xeroderma?pigmentosum?group?D，XPD)基因又稱切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因(excision?repair?cross-complementing?group2，ERCC2)，位于第19號染色體長臂q1313，有23個外顯子，在核苷酸剪切修復(fù)過程中負(fù)責(zé)松解受損DNA?雙螺旋；且參與基因轉(zhuǎn)錄過程,?是RNA?聚合酶Ⅱ介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄過程中不可缺少的組成部分。XPD能打開損傷部位的DNA雙鏈，為后續(xù)的切除和修復(fù)過程提供必要的條件。因而它可識別與修復(fù)基因結(jié)構(gòu)無關(guān)的大范圍損傷，清除體內(nèi)多種DNA損傷。

目前已在XPD基因的編碼區(qū)上發(fā)現(xiàn)8個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)(4個同義，4個為非同義)，而大部分研究集中在第751密碼子的Lys751Gln這個多態(tài)性位點(diǎn)。XPD基因第751密碼子A→C突變導(dǎo)致Lys751?→Gln751?氨基酸替代，大量的研究認(rèn)為與Lys/?Lys?基因型相比，攜帶Lys/?Gln?或Gln?/?Gln基因型可顯著降低染色單體型畸變的修復(fù)能力。而且不同的種族人群中，這個位點(diǎn)的等位基因頻率有很大的差異，如第751密碼子Gln/Gln純合子發(fā)生頻率在非洲裔美國人為6.9%，而在亞洲人群和高加索人群中分別為1.1%和13.4%。可見人類不同種群的遺傳背景是有明顯差異的。

隨著檢測技術(shù)和檢測結(jié)果評價的規(guī)范化，可以通過檢測外周血DNA修復(fù)基因XPD第751密碼子單核甘酸多態(tài)性初步預(yù)測不同癌患者對化療藥物的敏感度，從而實(shí)現(xiàn)個體化治療。

目前針對XPD基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的檢測普遍采用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法，用PCR擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同，產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。該方法簡便，結(jié)果容易判定，但是也同時存在諸多弊端，①靶片段的擴(kuò)增產(chǎn)物要純，如有非特異產(chǎn)物（特別是大片段可能含有酶識別序列）將競爭酶活性，使樣品消化不完全或及出現(xiàn)酶消化雜帶；②酶消化過程要充分（即底物與酶的比例要合適，消化時間要保證），避免假陰性結(jié)果；③酶切陽性結(jié)果可以確定所檢測具體序列，陰性結(jié)果僅可說明非酶識別序列，但不能準(zhǔn)確判定具體序列。④酶識別序列如有甲基化之核苷酸將不被切割。

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發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供用快速，準(zhǔn)確，高通量地檢測XPD基因熱點(diǎn)突變（Lys751Gln）的方法、引物和試劑盒。

本發(fā)明提供用于檢測檢測人XPD基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物，所述引物包括：

(1)一對用于擴(kuò)增人XPD基因第23外顯子的特異性外側(cè)引物SEQ?NO1和SEQ?NO2，其堿基序列為：

SEQ?NO1：TCTGGATTATACGGACATCTC；

SEQ?NO2：Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT

(2)?一條特異性內(nèi)側(cè)測序引物SEQ?NO3，其堿基序列為：

SEQ?NO3：GCTAGAATCAGAGGAGACG.。

進(jìn)一步地，所述突變位點(diǎn)為Lys751Gln。

本發(fā)明還提供一種用于檢測檢測人XPD基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的方法，所述方法包括：

（i）提取樣品中的DNA；

（ii）利用一對特異性外側(cè)擴(kuò)增引物SEQ?NO1和SEQ?NO?2，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，其中SEQ?NO1：TCTGGATTATACGGACATCTC；SEQ?NO2：Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT；

（iii）將（ii）中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，確定是否擴(kuò)增成功；

（iv）若擴(kuò)增成功，利用一條特異性內(nèi)側(cè)測序引物SEQ?NO3對所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序，獲得所述擴(kuò)增產(chǎn)物的基因序列，其中?SEQ?NO3：GCTAGAATCAGAGGAGACG.；

（v）將所述基因序列與人XPD基因第23外顯子野生型基因序列進(jìn)行比對，判斷是否存在熱點(diǎn)突變位點(diǎn)。