[發明專利]用于定性、定量檢測棗瘋病植原體的引物、探針及其方法

有效

• 申請號: 201310455553.1
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103525923A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 羅明;韓劍;徐金紅;王同仁;張祥林
• 申請（專利權）人: 新疆農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12Q1/06
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于植物檢疫技術領域，涉及用于對棗瘋病植原體進行定性、定量檢測的引物、探針及其檢測方法，特別是涉及用實時熒光定量PCR技術對棗瘋病植原體進行定性、定量檢測的引物、探針及其方法。

背景技術

棗瘋病(Jujube?witches’broom，JWB)又稱“棗癌癥”是由植原體病原侵染導致的、在棗樹生產中危害最嚴重的毀滅性病害。植原體原稱類菌原體，為單細胞原核生物，無細胞壁，由生物膜包圍，可引起多種病害。根據植原體16S?rDNA基因序列為對象進行分析，可將植原體分為28個組。其中引起棗瘋病的棗瘋病植原體與榆樹黃化植原體、葡萄金黃化植原體等同為植原體榆樹黃化組成員。棗瘋病分布范圍廣，傳播速度快，致病力強，樹體一旦感病，終身攜帶，傳統的病害防治技術和栽培技術難以治愈。我國多數棗樹主栽品種對棗瘋病敏感，全國每年因棗瘋病死樹高達千萬株，直接經濟損失高達數億元，嚴重阻礙了棗樹產業的發展。要從根本上解決棗瘋病的防治問題是采取有效的預防措施，加強種苗(接穗、砧木)的檢疫檢驗，采用健康苗木(砧木、接穗)，建立無病苗木繁育體系，從源頭上杜絕病原才是控制棗瘋病發生蔓延的根本途徑，而建立和應用先進的病原檢測技術是紅棗無病苗木生產的核心所在。

植原體自發現后的10多年里，其檢測技術的發展一直沒有大的突破。傳統的電鏡觀察、血清學等檢測方法因為靈敏度低、周期長和操作繁瑣等不足，已不能滿足現代生產的需要。隨著分子生物學技術引入植原體病害研究領域，植原體鑒定和檢測技術才得到了較快的發展，如普通PCR、巢氏PCR等技術的應用使植原體檢測靈敏度和鑒定水平有了極大的提高，但這些方法整個過程繁雜，操作步驟多，而且需要PCR后處理，如瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色，紫外光觀察結果或通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測，如果要鑒定到種或組，還要進行限制性內切酶多態性分析(RFLP)，或者進行核酸序列測定和同源性比較，不僅需要多種儀器，而且費時費力，所使用的染色劑溴化乙錠對人體又有害，這些繁雜的實驗過程又給污染和假陽性提供了機會，嚴重影響對結果的正確判斷。為此研發一套簡單、快速、靈敏、準確的棗瘋病植原體實時熒光定量PCR檢測方法，以期滿足檢疫工作的需要。

熒光PCR(FQ-PCR)技術是美國珀金埃爾默公司(PerkinElmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術，該方法自產生以來，不斷發展完善，其中TaqMan探針實時熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中添加了一對引物的同時加入了一條標記了2個熒光基團的特異性TaqMan探針，在PCR擴增過程中TaqMan探針同PCR產物雜交，引起報告基團發出熒光信號，通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測實現對起始模板進行定性及定量分析。與常規PCR檢測方法相比，該法具有特異性強、耗時短、靈敏度高、穩定性好和定量等優點。

目前國內已建立了用于檢測植原體榆樹黃化組成員的實時熒光PCR檢測方法，但該方法僅能實現植原體組間的特異性檢測，無法對植原體榆樹黃化組內的植原體進行區分和鑒定。本發明在對植原體大量基因信息進行分析比較的基礎上，建立了棗瘋病植原體特異性的實時熒光定量PCR檢測方法，能較好的區分不同組間及組內的植原體，可大大提高棗瘋病植原體的檢測效率，從而滿足我國相關檢疫工作的需要。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于對棗瘋病植原體進行定性、定量檢測的引物、探針及其檢測方法，具有快速定性和定量檢測棗瘋病植原體的功能。本發明操作簡單，易于掌握，檢測精度高，可廣泛應用于實驗室等日常檢測工作。本發明為實現上述目的所采用的技術方案是。

(1)設計并提供用于棗瘋病植原體實時熒光定量PCR檢測的引物和探針。

引物的序列為：

上游引物JWB?Primer-F：5’-TGGTGAGGTAAAGGCTTA-3’；

下游引物JWB?Primer-R：5’-CTCCCGTAGGAGTTTGG-3’。

探針的序列為：

JWB-Probe：5’-FAM-AATGTGGCTGTTCAACCTCTCA-TAMRA-3’。

(2)提供棗瘋病植原體實時熒光定量PCR檢測方法，即首先從待檢測棗瘋病樣品中制備反應模板，并建立和優化實時熒光定量PCR反應體系，然后通過設定實時熒光PCR反應程序，利用熒光PCR儀對反應模板進行擴增和熒光收集。

(3)最后根據儀器給出每個樣品的Ct值，分析檢測結果。