[發(fā)明專利]用于定性、定量檢測棗瘋病植原體的引物、探針及其方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310455553.1
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103525923A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設計）人: 羅明;韓劍;徐金紅;王同仁;張祥林
• 申請（專利權(quán)）人: 新疆農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12Q1/06
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1.一種用于棗瘋病植原體定性、定量檢測的引物、探針，其特征在于，含有一條特異性循環(huán)探針和一對引物，所述引物對和探針的寡聚核昔酸序列為：?

上游引物JWB?Primer-F：5’-TGGTGAGGTAAAGGCTTA-3’?

下游引物JWB?Primer-R：5’-CTCCCGTAGGAGTTTGG-3’?

探針JWB-Probe：5’-AATGTGGCTGTTCAACCTCTCA-3’。?

2.如權(quán)利要求1所述用于棗瘋病植原體定性、定量檢測的引物、探針，其特征在于，其設計方法是：從NCBI中搜集全部植原體及有代表性細菌的16S?rDNA核酸序列，利用Omiga軟件對上述序列進行比較及一致性分析，找出棗瘋病植原體與其他植原體的基因差異位點，用軟件Beacon?Designer7.0篩選出一對特異性的PCR引物，在該引物對的擴增區(qū)域設定一條熒光Tapman探針，并利用NCBI中的Blast程序分別對上游引物、下游引物和探針進行比對，確保棗瘋病植原體特異性的引物和探針設計區(qū)域為棗瘋病植原體所特有，從而保證擴增產(chǎn)物的特異性。?

3.如權(quán)利要求1所述的引物對，其特征在于，所述引物對擴增位于棗瘋病植原體16S?rDNA基因202bp～299bp位點的片段，擴增片段大小為98bp。?

4.如權(quán)利要求1所述的用于棗瘋病植原體定性、定量檢測的探針，其特征在于，該探針的5’端具有報告熒光染料FAM標記，3’端具有淬滅熒光染料TAMRA標記。?

5.一種用于棗瘋病植原體定性、定量檢測的方法，該方法包括下列步驟：?

(1)采用植物基因組提取試劑盒(Plant?Genomic?DNA?Kit，TIANGEN)提取棗樹葉片總DNA，置于-40℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?

(2)以提取的植物總DNA為模板，分別設陽性對照、健康植株總DNA對照及無菌雙蒸水對照，采用JWB-Probe探針及JWB?Primer引物對進行實時熒光定量PCR檢測。?

(3)根據(jù)各樣本的反應Ct值，按照棗瘋病植原體實時熒光定量PCR檢測結(jié)果的陽性判定標準判定待檢樣本中是否存在棗瘋病植原體，即可實現(xiàn)棗瘋病植原體的定性檢測；并可通過預先建立的熒光定量PCR反應的標準曲線方程計算出檢測樣品中棗瘋病植原體16S?rDNA基因片段拷貝濃度，據(jù)此得到樣品中棗瘋病植原體的數(shù)量，從而實現(xiàn)定量檢測。?

6.如權(quán)利要求5所述的一種用于棗瘋病植原體定性、定量檢測的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR檢測的反應體系為20μL：包括2.5×realMasterMix8.0μL，20×Probe?Enhancer?solution1.0μL，10μmol/L的上游引物JWB?Primer-F0.5μL、10μmol/L的下游引物JWB?Primer-R0.5μL，10μmol/L的TaqMan探針JWB-Probe0.5μL，模板DNA1.0μL，補足滅菌ddH₂O至20μL。?

7.如權(quán)利要求5所述的一種用于棗瘋病植原體定性、定量檢測的方法，其特征在于，所述的實時熒光定量PCR檢測的反應程序為：95℃預變性2mmin；以95℃變性15s，60℃退火30s，68℃延伸1min進行40個循環(huán)，68℃設置FAM熒光通道采集熒光。?

8.如權(quán)利要求5所述的一種用于棗瘋病植原體定性、定量檢測的方法，其特征在于，所述的棗瘋病植原體實時熒光定量PCR檢測結(jié)果的陽性判定標準為：如果樣品熒光PCR擴增曲線的Ct值≤34，而且同時陰性對照及空白對照無擴增曲線，則判定待檢樣品中含有棗瘋病植原體，否則該樣本不含棗瘋病植原體。?

9.如權(quán)利要求5所述，其特征在于，所述熒光定量PCR反應的標準曲線方程為：y＝-3.354x+38.27，x為所測樣品中棗瘋病植原體16S?rDNA基因片段拷貝數(shù)的對數(shù)，y為Ct值。?