[發明專利]新型超靈敏性ELISA方法的建立

有效

• 申請號: 201310455146.0
• 申請日: 2013-09-29
• 公開（公告）號: CN103513027A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 高峰;姜春來;范培虎;孔維
• 申請（專利權）人: 長春百克生物科技股份公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N21/64
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;姜建成

技術領域

本發明涉及一種免疫學檢測方法，尤其地涉及一種新的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法。?

背景技術

酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked?immunosorbent?assay,ELISA），是一種基于抗原抗體間特異性反應建立的用于檢測樣品中抗原或抗體的免疫學檢測方法，該方法具有簡潔、快速、靈敏等特點。自從Engvall和Perlmann于1971年^[1]發明以來該方法得到了迅猛的發展，已廣泛應用于各種抗原抗體的檢測。其基本原理是將酶分子共價偶聯在抗體或抗抗體分子上，這種偶聯不改變抗體的免疫學特性以及酶的催化活性，酶標抗體再與吸附在固相載體上的抗原或抗體特異性結合，加入酶底物溶液后，底物在標記酶的催化下產生顏色反應，根據顏色反應的強弱來判斷樣品中抗原或抗體的含量。ELISA方法集酶催化反應的靈敏性和抗原抗體間結合的特異性于一體，從而賦予了此方法高靈敏性和高特異性。?

以抗原抗體間特異性結合為基礎的免疫學定量檢測方法始于1959年由Yalow和Berson^[2]發明的用放射性同位素標記來檢測胰島素的放射免疫試驗。此后科學工作者在研究此類方法時發現，雖然該方法具有靈敏度高的優點，但同時存在用于標記的同位素對人身傷害性大，而且需要復雜的檢測設備等缺點，因此大大限制了此方法的發展和廣泛應用。1971年，Engvall和Perlmann用堿性磷酸酶代替放射性同位素標記抗體定量檢測了血清中的免疫球蛋白，成功地建立了酶聯免疫吸附試驗，自此免疫血清學試驗進入了酶標記時代。酶標記法較之前有明顯的優點，首先該標記為共價標記，具有較好的穩定性，可保持數月至數年有效。其次，酶催化反應為顯色反應，讀數時僅需要廉價簡單的光學儀器。再次，酶催化反應具有高效性，所以保證了ELISA方法的高度靈敏性，這也是該方法一個顯著的特點。用于標記的酶應?該具備下特性：在不破壞抗原抗體結合的溫度和pH條件下具有高度的酶活性；能夠以簡易敏感的方法檢出；能夠被大量地高度純化，且保持可溶性和穩定性；應具有能夠與抗原抗體共價結合的活性基團，并且結合后不影響其催化活性以及抗原抗體的結合活性；反應產物易于顯現^[3]。目前應用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、脲酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應用最為廣泛。HRP最常用的可溶性顯色底物為聯苯二胺（OPD）和四甲基聯苯胺（TMB），其中,TMB是一種優于OPD的新型HRP色原底物。在HRP和H₂O₂的存在下，OPD氧化而聚合成2,2’—二氨基偶氮苯，pH=1.0時，最大吸收波長492nm；TMB氧化產生聯苯醌，最大吸收波長450nm。?