[發明專利]一種檢測豬藍耳病活疫苗JXA1-R株的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201310455113.6
• 申請日: 2013-09-29
• 公開（公告）號: CN103498008A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 宋志軍;祝衛國;王東東;羅小飛;宋延華
• 申請（專利權）人: 廣東溫氏食品集團股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市深研專利事務所 44229
• 代理人: 陳雅平

1.一種檢測豬藍耳病活疫苗JXA1-R株的方法，其特征在于，采用RFLP分析法，設計合成擴增豬藍耳病活疫苗JXA1-R株ORF1a?3195～3682位核苷酸片段的引物，提取待檢樣品中的RNA，通過RT-PCR，用所述引物擴增JXA1-R株ORF1a?3195～3682位核苷酸片段，擴增產物與限制性核酸內切酶SacⅡ進行酶切反應，酶切產物經過瓊脂糖凝膠電泳后出現長度487bp的條帶時判斷為待檢樣品中含有豬藍耳病活疫苗JXA1-R株。

2.根據權利要求1所述的檢測豬藍耳病活疫苗JXA1-R株的方法，其特征在于，所述RT-PCR為一步法RT-PCR，所述引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1~2所示。

3.一種檢測豬藍耳病活疫苗JXA1-R株的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括SEQ?ID?NO:1~2所示的引物核苷酸序列和限制性核酸內切酶SacⅡ。

4.根據權利要求3所述的檢測豬藍耳病活疫苗JXA1-R株的試劑盒，其特征在于，該試劑盒由一步法RT-PCR反應液和酶切反應液兩組試劑組成，其中：

一步法RT-PCR反應液：10倍稀釋的PCR緩沖液5μL，5U/μL的DNA聚合酶1μL，200U/μL的反轉錄酶1μL，10mM的dNTPs1μL，200U/μL的RNA酶抑制劑1μL，25mM?的MgCl₂?8μL，20μM的SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示的引物核苷酸序列各1μL，以及無RNA酶滅菌水28μL；

酶切反應液：0.1%(w/v)BSA?2μL，10倍稀釋的酶切反應緩沖液2μL，限制性核酸內切酶SacⅡ?1μL，滅菌雙蒸水?5μL；

所述PCR緩沖液由Tris-HCl、KCl和MgCl₂的混合水溶液組成，pH值為8.5，其中Tris-HCl濃度為100mM，KCl濃度為500nM，MgCl₂濃度為15nM；

所述酶切反應緩沖液由醋酸鎂、二硫蘇糖醇和醋酸鉀的混合水溶液組成，其中醋酸鎂的濃度為100mM，二硫蘇糖醇的濃度為5mM，醋酸鉀的濃度為660mM。

5.用權利要求4所述的檢測豬藍耳病活疫苗JXA1-R株的試劑盒檢測豬藍耳病活疫苗JXA1-R株的方法，其特征在于，待檢樣品提取RNA后使用所述一步法RT-PCR反應液進行擴增，RT-PCR反應程序為：50℃?30分鐘；94℃?2分鐘；94℃?45秒，55℃?45秒，72℃?1分鐘，共40個循環；72℃，延伸8～10分鐘；取部分擴增產物加入到酶切反應液中，37℃下反應1小時；終止反應取酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過拍照觀察電泳條帶，如果出現487bp長度的片段判斷為待檢樣品中含有豬藍耳病活疫苗JXA1-R株。