[發明專利]一種檢測豬藍耳病活疫苗JXA1-R株的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201310455113.6
• 申請日: 2013-09-29
• 公開（公告）號: CN103498008A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 宋志軍;祝衛國;王東東;羅小飛;宋延華
• 申請（專利權）人: 廣東溫氏食品集團股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市深研專利事務所 44229
• 代理人: 陳雅平

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測技術領域，具體涉及一種檢測豬藍耳病活疫苗JXA1-R株的方法及試劑盒。

背景技術

高致病性豬藍耳病是由高致病性的豬藍耳病毒（又稱豬繁殖與呼吸綜合征病毒，porcine?reproductive?andrespiratory?syndrome?virus,?PRRSV）引起的母豬嚴重繁殖障礙、斷奶豬生長遲緩及死亡的傳染性疾病。該病自06年爆發以來，給國內養豬業造成了巨大的經濟損失，目前絕大多數豬場使用PRRSV變異株(JXA1-R)弱毒疫苗（即豬藍耳病活疫苗JXA1-R株，或簡稱JXA1-R疫苗株）對該病進行預防。高致病性豬藍耳病和普通豬藍耳病可用RT-PCR（逆轉錄聚合酶鏈式反應）進行鑒別檢測，但JXA1-R疫苗株與野毒株無法用現有的PCR（聚合酶鏈式反應）方法進行鑒別檢測。JXA1-R疫苗株可在豬體內繁殖并產生病毒血癥，這給高致病性豬藍耳病的實驗室診斷造成很大干擾，難以確定檢測到的高致病性豬藍耳病毒是疫苗毒還是野毒。

當前已有的JXA1-R疫苗株鑒別檢測方法有以下兩種：

方法一是使用北京世紀元亨動物防疫技術有限公司生產的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，以熒光定量PCR技術為基礎，在熒光定量PCR儀上進行反應，當有特定的擴增曲線時，則判定為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒（JXA1-R疫苗株）陽性，否則判定為陰性，一般需要3個小時完成實驗。該方法的核心技術包括反應體系和反應程序兩部分，反應體系的關鍵是引物和探針的核苷酸序列及其與酶類和鹽類的配制比例，各種試劑必須按其推薦的比例進行配制；反應程序的關鍵是控制好最佳退火和延伸時間。該方法雖然準確快速，但由于實驗所需的檢測試劑盒及熒光定量PCR儀比較昂貴，導致檢測成本較高。

方法二是采用測序法，以核苷酸的克隆和序列檢測技術為基礎，為常規序列分析方法。該方法需要的試劑包括特異性擴增引物、核酸提取試劑盒、通用的PCR試劑盒、核酸純化試劑盒、PMD-18T載體試劑盒及DH5α大腸桿菌，需要的儀器包括PCR儀、離心機、紫外透射儀、恒溫培養箱，具體操作步驟是先用特異性引物擴增待檢樣品核酸的特異基因片段，將目的基因片段純化后克隆入PMD-18T載體，再將克隆好的載體送往測序公司進行測序，最后將測得序列與高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒（JXA1-R疫苗株）進行比對，與疫苗毒核酸同源性較高，且特殊位點未發生變異的，則判定為JXA1-R株，檢測一次一般需要7～10天時間。同樣存在成本高的問題，另外檢測周期也較長。

發明內容

為了解決現有技術中的上述問題，本發明提供了一種簡單快速的檢測豬藍耳病活疫苗JXA1-R株的方法。

PRRSV的基因組全長約15kb，含有9個開放閱讀框（ORFs），順序依次為5’-ORF1a-ORF1b-ORF2a-ORF2b-ORF-(3-7)3’。每個閱讀框與相鄰的閱讀框均有少量的重疊。通過BLAST軟件將JXA1-R疫苗株與2010年前（2010年開始使用JXA1-R株弱毒疫苗）NCBI上發表的PRRSV的其他毒株核苷酸序列進行比對，發現JXA1-R疫苗株在其ORF1a?3195～3682位基因序列中特異缺失限制性核酸內切酶SacⅡ的酶切位點，本發明利用限制性內切酶片段長度多態性（Restriction?Fragment?Length?Polymorphism，RFLP）分析技術原理，通過這一特殊缺失的酶切位點，結合RT-PCR（Reverse?Transcription-Polymerase?Chain?Reaction，逆轉錄PCR）方法，對高致病性的豬藍耳病JXA1-R疫苗株進行鑒別檢測，即能準確鑒別JXA1-R疫苗株與其他PRRSV感染樣品。

本發明的具體技術方案如下：

一種檢測豬藍耳病活疫苗JXA1-R株的方法，是采用RFLP分析法，設計合成擴增豬藍耳病活疫苗JXA1-R株ORF1a?3195～3682位核苷酸片段的引物，提取待檢樣品中的RNA，通過RT-PCR，用所述引物擴增JXA1-R株ORF1a?3195～3682位核苷酸片段，擴增產物與限制性核酸內切酶SacⅡ進行酶切反應，酶切產物經過瓊脂糖凝膠電泳后出現長度487bp的條帶時判斷為待檢樣品中含有豬藍耳病活疫苗JXA1-R株。

作為一種優選方案，上述檢測豬藍耳病活疫苗JXA1-R株的方法中，所述RT-PCR為一步法RT-PCR，所述引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1~2所示。