[發明專利]一種植物小RNA的快速提取方法

有效

• 申請號: 201310454607.2
• 申請日: 2013-09-29
• 公開（公告）號: CN103484451A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 王靜毅;馮仁軍;柴娟;馬子龍;武耀廷
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 海口翔翔專利事務有限公司 46001
• 代理人: 莫臻

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種提取方法，具體是一種植物小RNA的快速提取方法。

背景技術

小RNA(non-coding?small?RNA)是一類長20-30個核苷酸(nucleotide,nt)的內源非編碼RNA分子，已在動物，植物，藻類以及真菌等多種真核生物中發現，它可在轉錄及轉錄后水平上調控基因的表達。小RNA主要包括小的干擾RNA(small?interfering?RNAs，siRNAs)和微小RNA(microRNAs,miRNAs)，它們可以通過與互補序列結合的方式，關閉或調節目標基因的表達，從而操縱著許多細胞功能。microRNA(miRNA)是繼siRNA之后新的研究熱點之一。植物miRNA廣泛參與植物的生長發育、細胞代謝、器官形態建成、激素分泌、信號轉導、脅迫應答等過程，因此小RNA已成為功能研究的熱點。

獲得高質量的小RNA是后續表達及功能研究的前提，尤其在構建小RNA文庫時，高質量的小RNA是成功建庫的關鍵和前提。

目前，許多關于植物RNA提取的方法已較為成熟，但這些方法大部分都不關注長度小于100bp的小RNA的去留，通常采用LiCl進行RNA的選擇性沉淀，結果導致大部分的小RNA丟失。

近幾年來，人們對miRNA的研究進展十分迅速。在植物界，雖然已經初步鑒定了擬南芥、水稻等主要模式植物中的miRNA，但大多數miRNA功能還不清楚。此外，除擬南芥、水稻等植物外，其它重要經濟作物(如香蕉)的miRNA分離和鑒定工作尚未啟動，miRNA的研究工作仍處于起步階段。

香蕉是一種重要的果糧兼備的熱帶經濟作物，其具有獨特的胞質遺傳特點，即線粒體父系和葉綠體母系遺傳，和其在基因組上具有不同的倍性水平，使得香蕉在研究栽培作物進化、在染色體和序列水平上分析親本基因組的互作雜交和多倍體作用方面成為最具有吸引力的模式植物，要想獲得高質量香蕉葉片小RNA，必須能夠有效除去多糖、酚類和蛋白質等干擾物質，并能在整個提取過程中抑制RNase的活性。雖然有關小RNA提取的試劑盒也被開發出來，但對于執拗性的植物（如香蕉）往往效果不佳，且昂貴的價格給研究工作帶來很大的經濟壓力，難以被普遍接受。目前，miRBase20.0數據庫中尚未收錄香蕉miRNA信息，關于香蕉組織特異性miRNA表達情況的研究亦未見報道。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種簡單、經濟、高效的植物小RNA的快速提取方法，為研究人員在實際工作中提供更多的選擇。本方法所提取的小RNA質量高，可以滿足RT-PCR，miRNA等研究的需要，同時可以大大降低實驗的成本。

本發明所采用的技術方案：

一種植物小RNA的快速提取方法，其步驟如下：

1）取植物組織（如植物的葉片、花蕾、果實等）在液氮中迅速研碎后與CTAB提取液混勻，加入量為每毫升CTAB提取液加入0.2g植物組織，65℃水浴10～60分鐘；

2）離心，取上清，用2倍上清液體積的水飽和酚/氯仿混合試劑抽提至無中間相；

3）離心，取上清，加入2倍上清液體積的無水乙醇和1／10上清液體積的pH值為5.2、濃度為3mol／L的醋酸鈉溶液，降溫至0℃，保持0℃并放置10分鐘以上；

4）離心，棄上清，沉淀物用300μl濃度為4mol／L的異硫氰酸胍溶液和100μl?pH值為4.0、濃度為2mol／L的醋酸鈉溶液重懸，加入1倍上清液體積的水飽和酚/氯仿混合試劑抽提至無中間相；

5）離心，取上清，加入2倍上清液體積的無水乙醇和1／10上清液體積的pH值為5.2、濃度為3mol／L的醋酸鈉溶液，降溫至0℃，保持0℃并放置10分鐘以上；

6）離心，棄上清，沉淀物用400μl?DEPC水溶解，加入50μl50%PEG8000和50μl5mol／L氯化鈉溶液，降溫至0℃，保持0℃并放置30分鐘以上；

7）離心，取上清，加入2.5倍上清液體積的無水乙醇和1/10上清液體積的pH值為5.2、濃度為3mol／L的醋酸鈉溶液，－70℃放置30分鐘以上；

8）離心，沉淀物以75%乙醇洗滌2～3次，風干后用DEPC水溶解，備用。

所述水飽和酚與氯仿組成的混合試劑中水飽和酚與氯仿的體積比為1︰1。

所述植物是指富含多糖多酚的植物。

所述的離心條件為：轉速8000～13000rpm，時間5～20分鐘。