[發(fā)明專利]去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310454382.0
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN103497938A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 虞方伯;管莉菠;駱林平;單勝道
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;B09C1/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶基因工程及酶工程領(lǐng)域，涉及一種去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑及應(yīng)用。

背景技術(shù)

隨著我國化學(xué)工業(yè)的快速發(fā)展，有機(jī)合成所產(chǎn)三廢(廢水、廢氣、廢渣)產(chǎn)生量呈逐年遞增之勢。上述三廢中存在大量對生物體有毒害作用的物質(zhì)，對環(huán)境造成了極為嚴(yán)重的污染和危害，威脅到人類和其它生物的安全和健康。其中，又以硝基芳香化合物的相關(guān)污染問題最為突出。

硝基芳香化合物廣泛存在于自然界中，主要應(yīng)用于染料、殺蟲劑、炸藥、農(nóng)藥、醫(yī)藥及其它化工產(chǎn)品的生產(chǎn)。隨著工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，進(jìn)入到環(huán)境中的硝基芳香化合物日益增多，給人類賴以生存的生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染。此外，由于硝基和苯環(huán)結(jié)構(gòu)的存在，使得硝基芳香化合物比其它化合物更難于生物降解。如何減少和去除此類化合物對生態(tài)環(huán)境的危害，已成為全社會共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

硝基芳香化合物的去除主要有物理法、化學(xué)法和微生物降解法三種。物理和化學(xué)方法雖然能夠有效去除此類物質(zhì)，但成本高，需要特制的儀器和裝備，且酸、堿易腐蝕，具有一定的危險(xiǎn)性。實(shí)際上，硝基芳香化合物在環(huán)境中的降解和轉(zhuǎn)化主要是由微生物完成的(微生物對其的代謝多通過一系列酶促反應(yīng)完成)。因此，如何充分利用好功能微生物資源，去除特異性污染物，成為了修復(fù)相關(guān)環(huán)境的迫切需要。

鄰硝基苯甲酸(2-NBA)是有機(jī)合成和制備染料、香料，潤滑脂和潤滑油的抗氧劑和金銹劑等的重要中間體，其工業(yè)需求量十分巨大。該物質(zhì)對環(huán)境有危害，會對水體和大氣造成污染，易在大氣化學(xué)和大氣物理變化中形成酸雨。當(dāng)pH值降到5.0以下時(shí)，2-NBA會給動(dòng)、植物造成嚴(yán)重危害，魚的繁殖和發(fā)育會受到嚴(yán)重影響。此外，水體酸化還會導(dǎo)致水生生物的組成結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，耐酸的藻類、真菌增多，而有根植物、細(xì)菌和脊椎動(dòng)物減少，有機(jī)物的分解率降低。如何高效、低成本，且環(huán)境友好的去除2-NBA頗具研究意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑。

本發(fā)明的另一目的是提供該酶制劑的應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑，所述的酶制劑為水溶液或緩沖溶液，包含一種鄰硝基苯甲酸降解酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，以及終濃度為0.1-0.3mM的MnCl₂，反應(yīng)體系pH值為6.0-8.0。酶制劑為緩沖溶液時(shí)，該緩沖溶液一般為pH值7.2-7.7的50-100mM磷酸鈉緩沖液或磷酸鉀緩沖液。進(jìn)一步的，所述的鄰硝基苯甲酸降解酶的純酶含量為0.03-0.1mg／mL。所述的MnCl₂終濃度為0.2mM。

一種去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑的制備方法，其特征在于：取純化酶液樣本20mL和氯化錳，用pH值7.5的50mM磷酸鈉緩沖液定容至1L制成酶制劑，酶制劑中氯化錳的終濃度為0.1-0.3mM。

所述純化酶液樣本的制備方法如下：挑取含有重組質(zhì)粒的菌株，該重組質(zhì)粒上含有nbaB基因編碼片段，用LB培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)，待A_600nm值為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度1mM，隨后于20℃過夜表達(dá)，離心收集細(xì)胞，重懸于50mM?pH7.5的磷酸鈉緩沖液，在冰水浴中超聲破碎細(xì)胞——功率為400W超聲波破碎5s，暫停15s，共進(jìn)行60個(gè)循環(huán)；隨后，于4℃，10000g離心30min去除細(xì)胞碎片，上清液即為粗酶提取液；使用一站式組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對上述粗酶提取液進(jìn)行純化，獲得純化酶液樣本。

所述的酶制劑在降解土壤中鄰硝基苯甲酸中的應(yīng)用。應(yīng)用所述酶制劑降解土壤中鄰硝基苯甲酸時(shí)，體系溫度為18-36℃，pH為6.0-8.5。

本發(fā)明從Pseudomonas?sp.ONBA-17中克隆得到負(fù)責(zé)2-NBA代謝的基因片段——nbaB。本發(fā)明能夠?yàn)?-NBA的降解提供有效的生物技術(shù)手段，對于2-NBA污染環(huán)境的修復(fù)具有重要意義。該菌是假單胞菌屬(Pseudomonas?sp.)的菌株ONBA-17，于2013年9月2日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC?No.8095。保藏單位的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所，該菌的分類命名為假單胞菌Pseudomonas?sp.。

本發(fā)明酶制劑的有益效果主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

(1)通過優(yōu)選添加金屬化合物，使得本發(fā)明的酶制劑酶活高，降解2-NBA效果優(yōu)異；