[發明專利]利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法

無效

• 申請號: 201310451398.6
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN103525779A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 徐家萍;高娟;王文兵;鮑先巡;劉明輝
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務所 34116
• 代理人: 胡敏

1.一種利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，步驟包括：

(1)將通過修飾加有His標簽的dck基因及polh基因分別克隆到雙啟動子表達載體以構建重組雙啟動子表達載體；

(2)將所述重組雙啟動子表達載體轉化到DH10Bac感受態細胞中，提取質粒，獲得重組穿梭載體Bacmid；

（3）所述Bacmid在轉染試劑脂質體介導下轉染家蠶培養細胞，獲得重組病毒多角體；

(4)所述重組病毒多角體定量后以經口接種五齡家蠶幼蟲的方式，在家蠶幼蟲中表達，表達產物通過Ni-NTA親和層析的方法純化，獲得具有酶活性的脫氧胞苷激酶DCK。

2.根據權利要求1所述的利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，所述步驟（1）雙啟動子表達載體為pFastBacDual。

3.根據權利要求2所述的利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，所述dck基因及polh基因分別插入雙啟動子表達載體pFastBacDual的Pp10和Pph的MCS的下游處構建重組雙啟動子表達載體。

4.根據權利要求1所述的利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，所述步驟（2）中重組穿梭載體Bacmid是通過將mini-Tn7轉座子從雙啟動子表達載體轉位到穿梭載體Bacmid上mini-attTn7靶位點，得到Gen抗性，再通過通過涂布于含有Kan，Gen，Tet，IPTG，X-gal的LB平板上進行藍白斑篩選，挑選白斑過夜振蕩培養，堿裂解法提取獲得的。

5.根據權利要求1所述的利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，所述在步驟（3）中轉染試劑脂質體介導是指重組Bacmid及脂質體，分別加入無血清的Bm細胞培養基，將兩種溶液混勻，室溫靜置，另取生長良好的Bm細胞，加入無血清的Bm細胞培養基及重組Bacmid/脂質體復合物，培養一段時間，吸掉上清，加入含有10%血清的Bm細胞培養基，繼續培養，觀察。

6.根據權利要求1所述的利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，所述步驟（3）中定量的重組病毒多角體的濃度為2×10⁷NPB/ml。

7.根據權利要求1所述的利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，所述步驟（3）中重組病毒多角體的添食量為每頭蠶8μl。

8.根據權利要求1所述的利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，所述Ni-NTA親和層析純化是指收集受感染的家蠶血液，超聲破碎，離心取上清，與鎳離子親和層析柱結合，用不同濃度的咪唑緩沖液進行洗滌，用10mM的咪唑緩沖液洗脫雜蛋白，用250mM的咪唑緩沖液洗脫重組蛋白。