[發明專利]利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法

無效

• 申請號: 201310451398.6
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN103525779A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 徐家萍;高娟;王文兵;鮑先巡;劉明輝
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務所 34116
• 代理人: 胡敏

技術領域

本發明涉及一種利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法。

背景技術

脫氧胞苷激酶（Deoxycytidine?kinase，DCK)是人體四大激酶之一，它是催化抗病毒核苷類藥物在人體內磷酸化，發揮藥效的關鍵酶。它是一種大小為61KD的磷酸激酶，包括兩個30.5KD的相同亞基，是脫氧核苷酸生物合成補救途徑中的關鍵酶，在維持正常的脫氧核苷酸方面起著重要的生理學作用。DCK缺陷與抗病毒和抗腫瘤藥物的抗性有重要的關系，它可以激活細胞毒性核苷三磷酸衍生物的活化，在細胞耐藥性和藥物敏感性方面有著重要的作用。隨著核苷類抗腫瘤藥物毒性及抗性機理研究的不斷深人，將有助于人們開闊思路，設計出療效更高的新一代藥物，從而為腫瘤的研究和治療作出貢獻。

DCK類化合物經過十幾年的發展,得到了許多高活性的化合物,但由于該類化合物的水溶性差,生物利用度低,使得該類化合物發展成臨床用藥進展較慢。前藥研究是最有可能將這類化合物發展成藥的一個重要方向。研究表明對邪蒿素類似物的不對稱雙羥化產物進行改造,期望引入氮原子,通過成鹽等方法增加化合物的水溶性,進而改善生物利用度。這類化合物具有作用機制獨特、活性高、抗耐藥性等特點,值得對其進行進一步的研究開發。

近年來，Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統得到廣泛應用，該系統根據F因子載體的原理，構建一種新桿狀病毒穿梭載體Bacmid,并且可以快速，同時分離多種重組病毒，有效解決了傳統繁瑣的空斑分析來篩選重組病毒的難題。該系統具有以下優勢：（1）重組率有顯著提高，幾乎可達100%。（2）大大地縮短了構建重組病毒所需要的時間，使由原來的4—6周或更長減少到僅7—10天。（3）通過藍白斑篩選重組病毒有針對性，不會產生野生型和非重組型病毒污染的問題。總之，該技術可以快速、同時產生多種重組病毒。

利用家蠶桿狀病毒作為表達載體時，應用最多的是將外源目的基因替代polh基因，利用Pph帶動目的基因高效表達。產生的重組病毒由于沒有多角體蛋白外殼的保護，只能通過皮下注射的方式接種家蠶，導致效率低下，因此可利用雙啟動子表達載體構建可同時表達dck基因和polh基因的表達載體，獲得的重組病毒，可經口接種家蠶，在家蠶幼蟲中表達抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶基因dck，并可以經過Ni-NTA親和層析純化。此方法與人工皮下注射家蠶相比，其優點省時省力，提高了生產效率，便于規模化生產，為家蠶生物反應器產業化提供了技術支撐，并為脫氧胞苷激酶DCK的研究提供了物質基礎。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法。

本發明是通過以下技術方案來實現的。

一種利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，步驟包括：

(1)將通過修飾加有His標簽的dck基因及polh基因分別克隆到雙啟動子表達載體以構建重組雙啟動子表達載體；

(2)將上述重組雙啟動子表達載體轉化到DH10Bac感受態細胞中，提取質粒，獲得重組穿梭載體Bacmid；

（3）上述Bacmid在轉染試劑脂質體介導下轉染家蠶培養細胞，獲得重組病毒多角體；

(3)上述重組病毒多角體定量后以經口接種五齡家蠶幼蟲的方式，在家蠶幼蟲中表達，表達產物通過Ni-NTA親和層析的方法純化，獲得具有酶活性的脫氧胞苷激酶DCK。

進一步地，上述步驟（1）雙啟動子表達載體為pFastBacDual。

進一步地，上述dck基因及polh基因分別插入雙啟動子表達載體pFastBacDual的Pp10和Pph的MCS的下游處構建重組雙啟動子表達載體。

進一步地，上述步驟（2）中重組穿梭載體Bacmid是通過將mini-Tn7轉座子從雙啟動子表達載體轉位到穿梭載體Bacmid上mini-attTn7靶位點，得到Gen抗性，再通過通過涂布于含有Kan，Gen，Tet，IPTG，X-gal的LB平板上進行藍白斑篩選，挑選白斑過夜振蕩培養，堿裂解法提取獲得的。

進一步地，上述在步驟（3）中轉染試劑脂質體介導是指重組Bacmid及脂質體，分別加入無血清的Bm細胞培養基,將兩種溶液混勻，室溫靜置,另取生長良好的Bm細胞，加入無血清的Bm細胞培養基及重組Bacmid/脂質體復合物，培養一段時間，吸掉上清，加入含有10%血清的Bm細胞培養基，繼續培養，觀察。