[發明專利]一種用于檢測阿特拉津的金標二抗信號放大SRP免疫傳感方法

有效

• 申請號: 201310450946.3
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN104515752B
• 公開（公告）日: 2017-07-18
• 發明（設計）人: 彭媛;高志賢;寧保安;白家磊;孫思明;柳明
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所
• 主分類號: G01N21/552
• 分類號: G01N21/552;G01N33/577;G01N33/532
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技術領域

本發明涉及一種信號放大表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)免疫傳感方法，用于高特異性與高靈敏度快速檢測阿特拉津，特別涉及于納米金標記二抗的SPR信號放大方法。

背景技術

阿特拉津(Atrazine，AT)屬三嗪類除草劑，通過抑制光合作用的電子傳遞而將雜草殺死，常用于防除玉米、高粱、甘蔗、果樹等旱田作物的一年生闊葉和禾本科雜草。噴灑在農田中的AT，大部分擴散至空氣或土壤里，然后隨著降水及灌溉用水滲入地下，造成地下水污染。有研究表明，AT是一種雌激素干擾物，具有致畸可能性，甚至很低劑量的暴露也會增加健康風險。而且，它在環境中若干年仍能保持活性，引起生態環境的破壞。因此，2004年，歐盟將其列為禁用農藥，日本也規定礦泉水中AT的最大殘留限量為2ppb。中國頒布的《地表水環境質量標準-GB3838-2002》中，限定AT在地表水的殘留量為3mg/L。美國國家環境保護局(U.S.Environmental Protection Agency，EPA)規定了飲用水中AT的最高允許濃度為3ppb，但是，美國地質調查局(United States Geological Survey，USGS)的研究表明，即使在低于EPA限定劑量的環境中，仍然能觀測到AT對魚類生殖的重大影響，會減少魚類的繁殖[88]和產卵，并發現魚的組織有異常。

因此，建立靈敏快速檢測AT的方法，對于保護環境以及人們飲水和食品安全是十分必要的。目前常用于AT檢測的方法有高效液相色譜法(HPLC)，酶聯免疫吸附分析法(ELISA)以及氣-質聯用方法。但是，這些方法較費時，費溶劑。近年來，隨著傳感技術的發展和交叉學科的興起，電化學傳感器、壓電傳感器及微懸臂梁質量傳感器，結合免疫技術、分子印跡技術越來越多地應用于環境監測領域，彌補了上述方法的不足。

表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)傳感技術是一類高新微測量技術，是當前國際傳感器領域的研究熱點。利用SPR傳感技術結合免疫分析技術，建立免疫傳感方法對污染物進行檢測，既發揮了SPR傳感器實時、快速、無需標記的優勢，又充分體現了免疫方法高特異性和高親和力的特點，而信號放大方法的建立也極大的提高了SPR免疫傳感的靈敏度，其具有很大開發潛力和廣闊的應用前景。

發明內容

本發明的目的是提供一種SPR免疫傳感器方法用于檢測阿特拉津。

本發明的第二個目的是提供一種運用納米金標記的二抗進行SPR信號放大的方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種SPR免疫傳感器運用納米金標記的二抗進行信號放大的方法，具體步驟如下：

(1)將芯片表面用巰基烷酸修飾，采用EDC/NHS方法，將阿特拉津完全抗原固定于芯片表面，通過調節完全抗原濃度控制包被濃度。

(2)將步驟(1)修飾的SPR芯片裝入儀器中，加入將不同溶度的小分子阿特拉津與阿特拉津單克隆抗體，進行競爭免疫反應。

(3)將納米金標記的二抗加入反應體系中進行信號放大，繪制阿特拉津濃度與SPR信號響應的標準曲線，計算方法線性范圍及最低檢測限。

(4)以不加膠體金標記的二抗為對照，在相同條件下進行間接競爭免疫實驗，驗證該方法的放大效果

(5)選擇撲草凈，三聚氰胺，毒死蜱，和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)作為類似物，進行特異性實驗。

(6)利用建立的檢測方法，連續多次對同一濃度的孔雀石綠溶液進行檢測→再生→檢測，測試所制備分子印跡膜的再生性能。

所述阿特拉津完全抗原優選為阿特拉津-OVA偶聯物，阿特拉津-BSA偶聯物。

所述納米金標記的二抗加入方式優選為與小分子和抗體一步加入，與小分子和抗體二步加入。

附圖說明

圖1納米金標記二抗的SPR免疫傳感信號放大意圖。

圖2阿特拉津-OVA固定化過程的SPR信號變化。

圖3納米金標記二抗信號放大SPR傳感器對阿特拉津的響應標準曲線。

圖4無納米金標記二抗與納米金標記二抗信號放大對比圖。

圖5阿特拉津及其類似物的特異性實驗結果。

具體實施方式

實施方式一：SPR檢測平臺的構建：