[發明專利]地西泮單克隆抗體篩選及其用途

無效

• 申請號: 201310450929.X
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN104513314A
• 公開（公告）日: 2015-04-15
• 發明（設計）人: 高志賢;寧保安;彭媛;白家磊;李桂敏;孫思明
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;G01N33/577
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及一種地西泮單克隆抗體的制備方法，特別是涉及一種地西泮單克隆抗體在快速檢測ELISA方法中應用，屬于生物技術領域。

背景技術

地西泮(Diazepam，DZP)，別名安定或苯甲二氮卓，化學名7-氯-1，3-二氫-1-甲基-5-苯基-2H-1，4-苯并二氮卓-2-酮，分子式C₁₆H₁₃C1N₂O，分子量284.76，DZP為白色或類白色的結晶粉末，熔點125-126℃，無臭，味苦；易溶于氯仿、丙酮、乙醇，幾乎不溶于水中。DZP屬于長效苯二氮卓類(結構式見圖1-2)抗焦慮藥，有抗焦慮、鎮靜、催眠、抗驚厥、抗癲癇、松弛骨骼肌肉及消除記憶等作用。廣泛應用于臨床醫學。研究表明，大量服用地西泮類藥物對人體健康是有害的，首先會使人對其形成依賴，常見的毒副作用包括困倦、眩暈、無力、頭昏眼花、記憶減退、精神疲軟、嗜睡和便秘等，為促進家畜增長，不法養殖者常在飼料中摻雜大量地西泮，家畜在食用后在體內經肝臟代謝，其代謝產物仍有生物活性，且可在體內富集。農業部公布的第193號文件《食用動物禁用的獸藥及其它化合物清單》中規定了21類近40個品種的藥物，其中包括催眠藥物DZP。而且由于其無色，安眠效果好，作用迅速，用藥劑量低而難以檢測等特點，地西泮常被用做犯罪的工具。

DZP的檢測方法多集中在臨床醫學、刑偵檢測方面，如血液、尿液、胃內溶物、肝中地西泮的檢測。常用的檢測方法有包括高效液相色譜法(HPLC)，薄層掃描法(TLC)，光化學熒光分析法(PCFA)，差示分光光度法及免疫分析法等。在不同的條件下，幾種檢測方法都發揮著自己的優勢。例如：HPLC檢測限低，靈敏度好。每種檢測方法也有自己的不足之處。如薄層層析法、光化學熒光分析法等檢測方法檢測限一般較低，只能作為臨床中毒檢測使用，不適合做為檢測動物可食組織中殘留檢測的方法。示差分光光度計法雖檢測限相對高，但樣品分離單一，不適合于樣品中含有多種成分的檢測。為了檢測多種成分，可將幾種檢測方法相結合，如氣質聯用(GC-MC)等，也可以達到檢測的目的；高效液相色譜法較其他方法靈敏度較高，可以解決部分實際問題。但其樣品前處理繁瑣、儀器昂貴、檢測成本高、需專業技術人員操作，且操作費時，分析效率低，技術普及困難，且大多數用于法醫上對中毒癥狀的鑒定，不適合可食動物組織中地西泮殘留的檢測，也不適用于現場快速大量檢測。免疫分析是利用抗原和抗體的特異性結合反應而對微量抗原或抗體進行測量的方法。酶聯免疫分析吸附方法(ELISA)是最常用的免疫分析技術之一。ELISA檢測方法彌補了理化檢測方法的缺憾，其最突出的優點是取樣量少、前處理簡單、儀器化程度低、靈敏度高，分析效率可達色譜分析方法的幾十倍，適用于大批量樣本的快速檢測。免疫分析的核心試劑是抗體，直接與分析的特異性和靈敏度相關，因此抗體的篩選和制備是免疫分析的前提和基礎。

發明內容

本發明的目的是提供一種地西泮單克隆抗體的制備方法，特別是涉及一種地西泮單

克隆抗體在快速檢測ELISA方法中應用，其技術方案概述如下：

一種地西泮單克隆抗體的制備方法，具體步驟如下：

(1)羧基化地西泮的合成

在DZP的3號位碳原子上生成酯，后再生成酸，改造羧基化的半抗原：充氮后分別注入四氫呋喃(THF)30mL和二異丙胺2.4mL(16.8mmol)；將反應瓶冷卻至-78℃，攪拌，注入丁基鋰6.6mL(15.6mmol)，并保溫反應1h；稱取DZP4g(14.05mmol)溶解在20mL?THF和10mL?HMPA中，加入反應瓶后升溫至-15℃，攪拌保溫30min;加入溶解在30mL?THF和4.6mLHMPA中的4-溴丁酸乙酯0.57g(5.62mmoL)，升溫至室溫，室溫反應24h，此時生成中間產物1;注入50mL飽和氯化銨淬滅反應，并分層，下層水相用乙酸乙酯萃取，得到有機相，并與上層有機相合并。將有機相水洗后，無水硫酸鈉除水;硅膠柱層析純化，乙酸乙酯與石油醚(V：V=1：3)為洗脫劑，得到黃色油狀物，此產物為中間產物2;將4g(10mmo?l)上述中間產物1和8g中間產物2溶于10％氫氧化鈉水溶液，室溫攪拌12h，然后加入3mol／Ｌ的HCl，柱層析純化，乙酸乙酯與石油醚(V：V=1：1)為洗脫劑，得微黃色固體，即為羧基化地西泮。

合成過程中利用薄層色譜法監控合成過程，終產物采用核磁共振氫譜鑒定。