[發明專利]地西泮單克隆抗體篩選及其用途

無效

• 申請號: 201310450929.X
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN104513314A
• 公開（公告）日: 2015-04-15
• 發明（設計）人: 高志賢;寧保安;彭媛;白家磊;李桂敏;孫思明
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;G01N33/577
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種地西泮單克隆抗體的制備方法，其特征由如下步驟組成：?

(1)羧基化地西泮的合成?

在DZP的3號位碳原子上生成酯，后再生成酸，改造羧基化的半抗原：充氮后分別注入四氫呋喃(THF)30mL和二異丙胺2.4mL(16.8mmol)；將反應瓶冷卻至-78℃，攪拌，注入丁基鋰6.6mL(15.6mmol)，并保溫反應1h；稱取DZP4g(14.05mmol)溶解在20mL?THF和10mL?HMPA中，加入反應瓶后升溫至-15℃，攪拌保溫30min;加入溶解在30mL?THF和4.6mLHMPA中的4-溴丁酸乙酯0.57g(5.62mmoL)，升溫至室溫，室溫反應24h，此時生成中間產物1;注入50mL飽和氯化銨淬滅反應，并分層，下層水相用乙酸乙酯萃取，得到有機相，并與上層有機相合并。將有機相水洗后，無水硫酸鈉除水;硅膠柱層析純化，乙酸乙酯與石油醚(V：V=1：3)為洗脫劑，得到黃色油狀物，此產物為中間產物2;將4g(10mmol)上述中間產物1和8g中間產物2溶于10％氫氧化鈉水溶液，室溫攪拌12h，然后加入3mol／Ｌ的HCl，柱層析純化，乙酸乙酯與石油醚(V：V=1：1)為洗脫劑，得微黃色固體，即為羧基化地西泮。?

(2)完全抗原的合成：用EDC法制備地西泮完全抗原，操作步驟如下：按摩爾比為1：2：2準確稱取DZP半抗原、EDC和NHS，溶于1mL無水DMF中，37(℃恒溫箱中避光、震蕩攪拌5h，此液為A液。按蛋白：小分子=1：30投料比稱取蛋白溶于PBS中，終濃度為5-10mg／mL，此液為B液。將A液用少量PBS稀釋，在震蕩器上將A液逐滴加到B液，4℃緩慢攪拌，反應過夜，透析液PBS(0.01mol／L、pH7.4)透析3天。?

(3)動物免疫與單抗篩選：選取6周齡雌性Balb／C小鼠作為免疫動物，DZP₁-BSA作為免疫原對動物實驗進行中劑量免疫(每兩周免疫一次，第一次免疫使用弗氏完全佐劑，其他采用弗氏不完全佐劑，免疫六次)，每次免疫后一周取小鼠血清ELISA測定效價，最后一次免疫后測定小鼠血清對DZP的競爭結合活性，競爭活性高的小鼠加強免疫一次，取脾進行細胞融合，按常規單克隆抗體制備方法進行單抗制備，篩選過程中采用固相篩選，包被原分別為DZP-OVA與DZP-BSA。?

2.一種地西泮單克隆抗體應用于地西泮快速檢測ELISA方法，其特征由如下步驟組成：?

(1)棋盤滴定法確定抗原抗體最佳濃度：棋盤滴定選擇最佳包被量及最佳抗體稀釋倍數，確定最佳包被原DZP-OVA濃度為1.25μg／mL、最佳抗體稀釋倍數為1：16000。?

(2)間接競爭ELISA方法建立：根據上述抗原抗體濃度，優化了一抗溫育時間為60min，二抗溫育時間45min，建立了間接競爭ELISA定量檢測地西泮的方法，其回歸曲線方程I=28.72641LgC+94.76472，R²=0.9555，得到靈敏度IC₅₀=0.0277μg／mL，線性范圍為0.0025～?

0.3062μg／mL，最低檢測限IC₁₀=0.0011μg／mL。?