[發明專利]酶解脫乙酰制備幾丁聚糖的方法

在審

• 申請號: 201310450777.3
• 申請日: 2013-09-29
• 公開（公告）號: CN104046670A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 白潔;李瑩;李雨田;苗勝昆;楊國元;許卉婷;楊之光;張原
• 申請（專利權）人: 天津天獅生物發展有限公司
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

?本發明涉及幾丁聚糖制備方法，屬于制造領域。

背景技術

?甲殼素是一種天然含氮多糖物質，廣泛存在與無脊椎動物的外殼或角質層中，尤其是蝦蟹類的外殼中。甲殼素很容易獲得，可再生，是僅次于纖維素的天然均聚物，但是因分子內部有很強的氫鍵作用，溶解性低，應用范圍受到限制。

甲殼素脫乙酰后生成殼聚糖。目前殼聚糖的制備多采用化學法和酶解法脫乙酰。化學法脫乙酰反應中，影響脫乙酰的因素很多，但是主要影響因素包括：堿液濃度、反應溫度和時間。一般來說，提高反應溫度和延長反應時間均可提高脫乙酰度，但是會導致甲殼素主鏈降解增加，從而影響產品的粘度和分子量。通入氮氣可以在一定程度上減緩主鏈的降解。由于化學法使用的堿液濃度高，反應時間長，產品質量不穩定，環境污染嚴重。

酶解法不會降解主鏈，并且無污染，具有重要的研究開發價值。影響酶解的因素很多，主要包括PH值和溫度。文獻記載最適宜PH值4-8，最適宜溫度30-70℃（《甲殼酶特性與應用研究》?萬云洋等?《天然產物研究與開發》?2003?vol?15?No.6）。迄今為止發現的真菌甲殼質脫乙酰酶（CDA）都是糖蛋白，且有良好的熱穩定性。但是不同來源CDA的存在位置、最適宜PH值（PH4.5-12）、碳水化合物含量、相對分子質量及離子影響等有較大的差異。

迄今報道的CDA基本都來源于真菌。真菌來源的CDA主要作用是自身細胞壁的合成，最適底物一般為甲殼寡糖，對甲殼質的活性較低，不適合用酶法脫乙酰生產殼聚糖。真菌來源的CDA來源廣泛，獲取容易，成本相對較低。因此如何能夠將真菌來源的CDA用于制備殼聚糖成為本領域技術人員急需解決的問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新的幾丁聚糖制備方法，所述的方法能夠較現有技術更節能環保。

本發明的另一目的是提供一種用真菌來源的CDA制備幾丁聚糖的方法，所述的方法能夠解決現有技術CDA不適于生產幾丁聚糖的技術難題。

本發明的另一目的是提供一種安全的幾丁聚糖制備方法，所述的方法制得的幾丁聚糖無強酸或強堿殘留，產品更安全。

本發明的另一目的是提供一種具有市場競爭力的幾丁聚糖，所述的產品不因工藝的改進而增加生產成本。

為達到上述目的，本發明采用下列技術方案實現：

干燥、粉碎、鹽酸脫鈣、酶解脫鈣和脫蛋白、脫乙酰、水洗干燥粉碎即得。

本發明采用制備方法對脫鈣前的蟹殼或蝦殼進行預處理，然后再進行酶解脫鈣和脫蛋白。

為增強脫鈣和脫蛋白效果，本發明優選的將蟹殼或蝦殼粉碎至0.5～1.0mm顆粒，顆粒過小則增加生產成本，顆粒過大效果較差。發明人經過多次試驗及經驗，最終確定0.5～1.0mm顆粒范圍達到脫鈣和成本的最佳性價比。

原料經粉碎后，加入8～15%鹽酸脫鈣，充分反應后，過濾，水洗至中性，留取殘渣。

本發明的酶解采用復合酶解方法進行脫蛋白，同時還具有進一步脫鈣的作用。經過篩選后，最終發現用菠蘿蛋白酶和中性蛋白酶進行酶解較其他蛋白酶具有更好的效果。當然，選用其他蛋白酶進行酶解也能夠實現本發明的目的。本發明工藝中最佳酶解方案是將蟹殼或蝦殼鹽酸脫鈣后的殘渣中加入4-8倍重量體積比的水制成料液，料液加入中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶重量比1:2～5的復合蛋白酶，加檸檬酸調PH值至5.5～6.5，40～60℃攪拌1～2h；分離液體，殘渣再次重復提取。

酶解殼料所用的復合蛋白酶占殼料重量比為0.05～0.2%為佳。

酶解脫鈣和脫蛋白后，過濾，棄濾液，留取殘渣，殘渣即為甲殼質。將甲殼質加入含有甲殼質脫乙酰酶的發酵液脫乙酰，甲殼質與發酵液的重量體積比（g/l）1～4:2～5，30～32℃,48～72h，0.2MPa，然后120℃滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。

所述的可以從公開市場上購得，也可以通過構巢曲霉菌發酵后制得。

所述的甲殼質脫乙酰酶制備方法如下：

（1）制備發酵培養基：酵母粉8g，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂1g，二氯化鈷（0.01mol/l）10ml，水1000ml；

（2）發酵條件：發酵培養基滅菌，接種構巢曲霉菌，30～35℃，PH6.0～7.0，72～96h。

經過酶解脫鈣和脫蛋白后，去除了原料中的鈣離子、蛋白質其它有機物質。

本發明所述的幾丁聚糖脫乙酰度高達95%以上。