[發明專利]復制缺陷型BmNPV載體的構建及應用

無效

• 申請號: 201310449980.9
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN103484499A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 陳健;陳琴;費偉強;錢月忠;于威;呂正兵
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/64
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.轉移載體pMD18-lef2-BAC-1629的構建方法，其特征是包括以下步驟：

1）、pMD18-lef2-1629載體構建：

①、分別進行BmNPV?lef2基因片段和orf1629基因片段的合成，

②、利用BmNPV?lef2基因片段和orf1629基因片段重疊PCR合成lef2-1629片段；

③、構建pMD18-lef2-1629：

先對lef2-1629片段3'端加“A”，所得的加“A”后的PCR產物連接到T載體，得pMD18-lef2-1629；

2）、轉移載體pMD18-lef2-BAC-1629的構建：

①、細菌人工染色體BAC片段的合成

以bMON14272DNA作為模板，利用KOD?FX?DNA聚合酶PCR擴增BAC片段，得BAC片段PCR產物；

②、BAC片段克隆到pMD18-lef2-1629：

先將pMD18-lef2-1629與BAC片段PCR產物分別用FseI進行單酶切反應；pMD18-lef2-1629酶切產物割膠回收后去磷酸化，再與酶切回收的BAC片段PCR產物用DNALigation?Kit?LONG試劑盒進行連接，連接產物轉化HST08感受態細胞，得轉移載體pMD18-lef2-BAC-1629。

2.復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid的構建方法，其特征是：首先構建家蠶桿狀病毒穿梭載體BmBacmid，再利用Red重組技術敲除病毒復制必需基因orf1629的部分序列，從而構建復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid；該復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid可以構建重組病毒表達目的蛋白。

3.根據權利要求2所述的復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid的構建方法，其特征是：

所述家蠶桿狀病毒穿梭載體BmBacmid的構建為：

取轉移載體pMD18-lef2-BAC-1629DNA和四方形多角體BmNPV病毒DNA混勻后與X-tremeGENE?HP轉染試劑混合共轉染單層家蠶BmN細胞；所得的病毒基因組DNA電轉化ElectroMAX?DH10B感受態細胞，涂布于Kan/IPTG/X-gal?LB固體培養基上培養24～48h；然后轉印至Amp/IPTG/X-gal?LB固體培養基上培養12h，隨機挑取Kan抗性Amp敏感的藍色單菌落接種Kan?LB液體培養基（50μg/mL?Kan），37℃搖床中220r/min振蕩培養48h；得穿梭載體BmBacmid，含該穿梭載體BmBacmid的DH10B細胞標記為BmDH10B。

4.根據權利要求3所述的復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid的構建方法，其特征是：

所述利用Red重組技術敲除病毒復制必需基因orf1629的部分序列，從而構建復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid包括以下步驟：

1）、orf1629基因打靶片段的制備

根據四方形多角體BmNPV病毒orf1629基因及pKD3質粒中氯霉素抗性基因表達盒序列設計引物；然后以pKD3質粒DNA作為模板，KOD?FX?DNA聚合酶進行擴增；PCR產物純化后，得orf1629基因打靶片段；

2）、Red重組構建復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid：

以pKD46-RecA質粒轉化BmDH10B感受態細胞，在Amp/Kan?LB平板上篩選陽性克隆，得BmDH10B感受態細胞；

所述BmDH10B感受態細胞以orf1629基因打靶片段電轉化后，進行篩選培養；得復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid。

5.如權利要求2～4任一方法構建而得復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid的用途，其特征是：用于構建重組病毒表達目的蛋白。