[發明專利]復制缺陷型BmNPV載體的構建及應用

無效

• 申請號: 201310449980.9
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN103484499A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 陳健;陳琴;費偉強;錢月忠;于威;呂正兵
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/64
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明屬于生物技術中利用基因工程方法載體構建的技術領域。?

背景技術

昆蟲桿狀病毒表達系統主要有兩個，一個是應用最為廣泛以Sf9、Sf21細胞或苜蓿銀紋夜蛾為宿主的AcMNPV載體表達系統，另一個是感染家蠶細胞或幼蟲、蛹表達外源基因的家蠶桿狀病毒（BmNPV）表達載體系統。在這種表達系統中重組病毒的成功構建是關鍵。早期的BmNPV載體系統產生重組病毒效率低，需要繁瑣耗時的多步篩選步驟。目前主要是以BmBacmid或者線性化的BmNPV為主構建重組病毒，表達目的蛋白。最近還出現了一種利用條件性復制載體轉座構建重組BmBacmid的技術，利用這種技術可大大提高篩選重組BmBacmid的成功率。不過，這種操作仍然需要在特定的大腸桿菌中完成，無法脫離這個中間步驟。總之，雖然現在的技術和方法相比較早期的技術有很大進步，但最終成功構建重組病毒還是需要多步操作，相對還是比較繁瑣耗時的。?

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種復制缺陷型BmNPV載體的構建及應用；本發明利用同源重組的方法構建穿梭載體BmBacmid，進而通過Red重組技術構建一種復制缺陷型的BmNPV載體。利用這種復制缺陷型載體可一步構建重組病毒，無需篩選，從而建立一種快速構建BmNPV重組病毒表達目的蛋白的方法。?

為了解決上述技術問題，本發明提供一種轉移載體pMD18-lef2-BAC-1629的構建方法，包括以下步驟：?

1）、pMD18-lef2-1629載體構建：?

①、分別進行BmNPV?lef2基因片段和orf1629基因片段的合成，?

②、利用BmNPV?lef2基因片段和orf1629基因片段重疊PCR合成lef2-1629片段；?

③、構建pMD18-lef2-1629：?

先對lef2-1629片段3'端加“A”，所得的加“A”后的PCR產物連接到T載體（pMD18-Tsimple），得pMD18-lef2-1629；?

2）、轉移載體pMD18-lef2-BAC-1629的構建：?

①、細菌人工染色體BAC片段的合成?

以bMON14272DNA作為模板，利用KOD?FX?DNA聚合酶PCR擴增BAC片段，得BAC片段PCR產物；?

②、BAC片段克隆到pMD18-lef2-1629：?

先將pMD18-lef2-1629與BAC片段PCR產物分別用FseI進行單酶切反應；pMD18-lef2-1629酶切產物割膠回收后去磷酸化，再與酶切回收的BAC片段PCR產物用DNALigation?Kit?LONG試劑盒進行連接，連接產物轉化HST08感受態細胞，得轉移載體pMD18-lef2-BAC-1629。?

本發明還同時提供了復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid的構建方法，首先構建家蠶桿狀病毒穿梭載體BmBacmid，再利用Red重組技術敲除病毒復制必需基因orf1629的部分序列，從而構建復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid；該復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid可以構建（快速構建）重組病毒表達目的蛋白。?

作為本發明的復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid的構建方法的改進：?

家蠶桿狀病毒穿梭載體BmBacmid的構建為：?

取轉移載體pMD18-lef2-BAC-1629DNA和四方形多角體BmNPV病毒DNA混勻后與X-tremeGENE?HP轉染試劑混合共轉染單層家蠶BmN細胞；所得的病毒基因組DNA電轉化ElectroMAX?DH10B感受態細胞，涂布于Kan/IPTG/X-gal?LB固體培養基上培養24～48h；然后轉印至Amp/IPTG/X-gal?LB固體培養基上培養12h，隨機挑取Kan抗性Amp敏感的藍色單菌落接種Kan?LB液體培養基（50μg/mL?Kan），37℃搖床中220r/min振蕩培養48h；得穿梭載體BmBacmid，含該穿梭載體BmBacmid的DH10B細胞標記為BmDH10B。?

作為本發明的復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid的構建方法的進一步改進：利用Red重組技術敲除病毒復制必需基因orf1629的部分序列，從而構建復制缺陷型BmNPV載體RD-BmBacmid包括以下步驟：?

1）、orf1629基因打靶片段的制備?