[發(fā)明專利]含BMP-2和ZsGreen1基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310446813.9
• 申請(qǐng)日: 2013-09-26
• 公開（公告）號(hào): CN103525851A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 岳建輝;趙曉麗;潘浩波;胡慶茂
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
• 主分類號(hào): C12N15/66
• 分類號(hào): C12N15/66;C12N15/85
• 代理公司: 深圳中一專利商標(biāo)事務(wù)所 44237
• 代理人: 張全文

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及BMP-2表達(dá)載體及其構(gòu)建，尤其涉及一種含BMP-2和ZsGreen1基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone?morphogenetic?protein，BMP)包括一系列結(jié)構(gòu)和功能相似的多肽，其中BMP-1是骨生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子并屬于金屬肽鏈內(nèi)切酶家族，其余BMP均屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β超家族。BMP-2是目前研究最為廣泛、誘導(dǎo)成骨活性最強(qiáng)的BMP之一。BMP-2具有誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞定向分化與增殖的能力，并具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟功能，并參與骨和軟骨的生長(zhǎng)發(fā)育及重建過程。BMP-2蛋白質(zhì)在細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)的分布和定位，是目前在分子和細(xì)胞水平上研究BMP-2促進(jìn)骨折愈合和骨組織修復(fù)的熱點(diǎn)。

目前，在目標(biāo)蛋白的定位技術(shù)方面的研究已經(jīng)取得很多進(jìn)展，不同的靶向蛋白的定位技術(shù)的原理也各不相同。目前用于BMP-2蛋白定位的方法主要有免疫熒光定位、構(gòu)建融合蛋白載體和免疫膠體金標(biāo)記法等。其中免疫熒光定位方法主要利用抗原與抗體相互結(jié)合的原理，該方法主要步驟為：首先將BMP-2抗體標(biāo)記上特定的熒光素制成抗體標(biāo)記物，然后利用該抗體標(biāo)記物作為探針，將其與細(xì)胞或者動(dòng)物體內(nèi)的BMP-2抗原進(jìn)行結(jié)合，利用熒光顯微鏡觀察，其中熒光素受照射發(fā)出各種熒光，從而可以確定BMP-2蛋白的定位和性質(zhì)。而構(gòu)建融合蛋白載體主要步驟為：構(gòu)建能表達(dá)含有綠色熒光蛋白和目的蛋白相互連接的融合蛋白的載體，并使其在動(dòng)物或者細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，通過在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，進(jìn)行靶蛋白的定位。免疫膠體金標(biāo)記法中，當(dāng)用金顆粒標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)時(shí)，在光鏡下呈現(xiàn)鮮艷的櫻紅色，從而獲得抗原的定位信息。

在現(xiàn)有技術(shù)中，免疫熒光定位方法對(duì)儀器的要求比較高，并且結(jié)果不能長(zhǎng)期保存。而對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的構(gòu)建融合蛋白載體方法，由于兩個(gè)不同的基因相互連接，在翻譯成蛋白的時(shí)候兩個(gè)蛋白之間的空間構(gòu)象極易發(fā)生改變而無法正確折疊，從而使熒光蛋白或者靶蛋白失去活性而無法達(dá)到定位或者對(duì)靶蛋白進(jìn)行功能研究的目的。免疫膠體金標(biāo)記法成本高，需要較大直徑的金顆粒(40-50nm)才能獲得較高的靈敏度，同時(shí)耗費(fèi)抗體量較多，檢測(cè)過程中需要較高濃度的標(biāo)記物，并且當(dāng)金顆粒過大時(shí)，標(biāo)記物不穩(wěn)定，長(zhǎng)期貯存容易發(fā)生自動(dòng)聚集。因此需要開發(fā)一種簡(jiǎn)便快速成本低的BMP-2蛋白定位檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種含形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)和ZsGreen1基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中BMP-2蛋白定位成本高效果不好的問題。

本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種含BMP-2和ZsGreen1基因的表達(dá)載體構(gòu)建方法，包括：

S01.通過PCR方法將BMP-2基因擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；

S02.將該擴(kuò)增產(chǎn)物和pIRES2-ZsGreen1載體分別利用XhoI和BamHI酶進(jìn)行雙酶切處理，將所得含BMP-2基因的雙酶切產(chǎn)物和含ZsGreen1基因的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行粘性末端連接，

其中所述通過PCR方法將BMP-2基因擴(kuò)增時(shí)使用的引物對(duì)為：SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2。

本發(fā)明實(shí)施例還提供利用本發(fā)明的方法構(gòu)建的含BMP-2和ZsGreen1基因的表達(dá)載體。

本發(fā)明實(shí)施例還提供本發(fā)明的含BMP-2和ZsGreen1基因的表達(dá)載體用于誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的應(yīng)用，該應(yīng)用包括將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟。

本發(fā)明實(shí)施例采用了含有IRES序列的熒光報(bào)告載體，構(gòu)建了能夠同時(shí)表達(dá)非融合的BMP-2蛋白和ZsGreen1綠色熒光蛋白的熒光報(bào)告載體，該載體可同時(shí)表達(dá)上述兩種蛋白，并且使得兩種蛋白的空間構(gòu)象和功能不會(huì)相互影響。因此通過該載體的表達(dá)可利用ZsGreen1綠色熒光蛋白對(duì)BMP-2蛋白表達(dá)和分泌進(jìn)行亞細(xì)胞定位。該表達(dá)載體可以應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)的研究中，可利用該表達(dá)載體實(shí)時(shí)觀察檢測(cè)BMP-2在動(dòng)物體內(nèi)不同組織表達(dá)分布情況。該表達(dá)載體的構(gòu)建，將更有利于探索BMP-2基因在骨折愈合、骨修復(fù)等方面的機(jī)制研究。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例中使用的pIRES2-ZsGreen1載體的序列位點(diǎn)及雙酶切位點(diǎn)示意圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中將表達(dá)載體pIRES2-ZsGreen1-BMP-2轉(zhuǎn)染至COS-1細(xì)胞系后的顯微鏡下觀測(cè)圖片；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例2中pIRES2-ZsGreen1-BMP-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的轉(zhuǎn)染效率圖；