[發明專利]通過侵入性切割添加銜接子

在審

• 申請號: 201310446354.4
• 申請日: 2013-09-26
• 公開（公告）號: CN103774242A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: F.達爾;O.J.埃里克森;H.約翰森;M.斯里尼瓦桑
• 申請（專利權）人: 安捷倫科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 羅天樂

背景技術

分子生物學中的幾種分析方法（例如，測序文庫的制備）需要將銜接子放置到DNA片段的末端，以提供操作該片段的手段。例如，可以將一個或多個銜接子連接到DNA的片段上以產生連接有銜接子(adaptor-ligated)的片段，且可以利用該添加的銜接子中存在的引物結合位點將所述連接有銜接子的片段擴增和/或測序。

發明內容

本文提供一種方法，其包括：a)使基因組DNA與銜接子雜交，其中所述銜接子包含：雙鏈區域、包含5’突出端(5’overhang)的單鏈區域、以及用于后續的酶處理的核苷酸序列；其中所述5’突出端與所述基因組DNA雜交從而產生瓣式內切核酸酶(flap?endonuclease)的底物；b)使用所述瓣式內切核酸酶切割所述底物以產生這樣的產物：其包含所述銜接子以及瓣式內切核酸酶生成的基因組DNA的片段，所述片段雜交于(is?hybrized?to)所述5’突出端，并能夠連接至所述雙鏈區域的凹入末端(recessed?end)；c)將所述雙鏈區域的凹入末端連接至所述片段，以產生連接有銜接子的DNA；d)對該連接有銜接子的DNA的各末端進行分子內連接，以產生環形DNA分子；以及e)使用與所述銜接子雜交的寡核苷酸和酶對環形DNA分子進行酶處理。在一些情況中，銜接子的雙鏈區域可以含有供反向PCR引物結合的位點以用于擴增PCR。在這些實施方案中，酶處理可以包括使用結合那些位點的引物進行PCR來擴增所述環形DNA分子。可將擴增的產物測序。還提供了用于進行所述方法的試劑盒。

附圖說明

本領域技術人員會理解，以下所描述的圖僅僅是用于例示的目的。這些圖并非意圖以任何方式限制本發明的范圍。

圖1是示意性地例示目的方法的一個實施方案的圖。

圖2是示意性地例示一種可測序環形DNA分子的方式的圖。

定義

在更詳細地描述例示性的實施方案之前，給出以下的定義以例示和定義在本說明書中所使用的術語的含義和范圍。

數值范圍包括限定該范圍的數字。除非另外指出，否則核酸是從左到右以5’到3’的方向書寫；氨基酸序列是從左到右以氨基端到羧基端的方向書寫。

除非另外定義，否則本文中所使用的所有技術和科學術語均具有本領域技術人員所通常理解的含義。Singleton等人,DICTIONARY?OF?MICROBIOLOGY?AND?MOLECULAR?BIOLOGY,2D?ED.、John?Wiley和Sons,New?York(1994)、以及Hale&Markham,THE?HARPER?COLLINS?DICTIONARY?OF?BIOLOGY,Harper?Perennial,N.Y.(1991)提供本領域技術人員以本文中所用的許多術語的含義。不過為了清楚和容易參考，下面定義了一些術語。

必須注意在本文中以及在所附的權利要求書中所使用的單數形式的“一個”或“一種”（“a”,“an”,and“the”）包括復數是指，除非上下文清楚地顯示并非如此。例如，術語“一種引物”是指一種或多種引物，即，單一一種引物和多種引物。還應注意可以撰寫權利要求以排除任何任選的要素。因而，該聲明是意圖作為使用與對權利要求要素的敘述關聯的排除性的術語，如“只”、“僅僅”和類似的術語，或使用“否定性”限定的在先基礎。