[發明專利]通過侵入性切割添加銜接子

在審

• 申請號: 201310446354.4
• 申請日: 2013-09-26
• 公開（公告）號: CN103774242A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: F.達爾;O.J.埃里克森;H.約翰森;M.斯里尼瓦桑
• 申請（專利權）人: 安捷倫科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 羅天樂

1.一種方法，其包括

a)使基因組DNA與銜接子雜交，其中所述銜接子包含：

雙鏈區域；

包含5’突出端的單鏈區域；以及

用于后續的酶處理的核苷酸序列；

其中所述5’突出端與所述基因組DNA雜交而產生瓣式內切核酸酶的

底物；

b)使用所述瓣式內切核酸酶切割所述底物以產生產物，該產物包含所述銜接子以及瓣式內切核酸酶生成的所述基因組DNA的片段，所述片段雜交于所述5’突出端并能夠連接至所述雙鏈區域的凹入末端；

c)將所述雙鏈區域的凹入末端連接至所述片段而產生連接有銜接子的DNA；

d)對所述連接有銜接子的DNA的各末端進行分子內連接以產生環形DNA分子；以及

e）使用與所述銜接子雜交的寡核苷酸以及酶對所述環形DNA分子進行酶處理。

2.權利要求1的方法，其中所述酶處理包括引物延伸、測序、擴增、和/或酶切割。

3.權利要求1的方法，其中步驟e)包括(i)通過使用與所述銜接子雜交的反向PCR引物的PCR來擴增所述環形DNA分子，從而產生擴增子，以及(ii)對由(i)產生的所述擴增子測序。

4.權利要求1的方法，其中步驟e)包括(i)使用滾環擴增法擴增所述環形DNA分子從而產生產物，以及(ii)對(i)的所述產物測序。

5.權利要求3的方法，其中所述擴增是使用與所述雙鏈區域中的位點結合的一個或多個引物來實施的。

6.權利要求3的方法，其中所述擴增是通過克隆PCR進行的。

7.權利要求3的方法，其中在測序之前通過克隆PCR擴增步驟(i)的產物。

8.權利要求1的方法，其中所述雙鏈區域包含條形碼序列。

9.權利要求1的方法，其中所述切割步驟b)和所述連接步驟c)是在單一反應中實施的。

10.權利要求1的方法，其中所述分子內連接是使用單鏈連接酶實施的。

11.權利要求1的方法，其中所述5’突出端包含簡并序列和/或與任意核苷酸進行堿基配對的核苷酸類似物，并且其中所述切割在所述基因組DNA中的隨機位置發生。

12.權利要求11的方法，其中所述簡并序列包含一個或多個N，其中N是G、A、T或C。

13.權利要求11的方法，其中所述核苷酸類似物是肌苷。

14.權利要求11的方法，其中所述5’突出端包含一個或多個N，其中N是G、A、T或C，以及肌苷，其中鄰近于所述雙鏈區域的核苷酸是N，且遠離所述雙鏈區域的核苷酸是肌苷。

15.權利要求11的方法，其中可以增加或減少與所述基因組DNA雜交的所述銜接子的量，以獲得基因組DNA的更短或更長的片段。

16.權利要求11的方法，其中所述5’突出端包含與基因組中的靶基因座鄰近的確定的序列，并且其中所述切割發生在所述基因組DNA中的確定的位置。

17.權利要求11的方法，其中所述基因組DNA是人基因組DNA。

18.權利要求11的方法，其中所述雙鏈區域的長度是20-100個堿基對，并且所述單鏈區域的長度是20-100個堿基對。

19.一種試劑盒，其包含：

a）銜接子，其包含

雙鏈區域；

包含5’突出端的單鏈區域；以及

用于后續的酶處理的核苷酸序列；

其中所述5’突出端與基因組DNA雜交以產生瓣式內切核酸酶的底物；

b）瓣式內切核酸酶；

c）一種或多種連接酶；以及

d）與所述銜接子雜交的一種或多種引物。

20.權利要求19的試劑盒，其中所述一種或多種連接酶包括雙鏈連接酶和單鏈連接酶。