[發(fā)明專利]一種豬源成分摻假的快速試紙檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310445819.4
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN103487576A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王琴;馮永巍;田耀旗
• 申請（專利權(quán)）人: 無錫市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N21/78
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

一種豬源成分摻假的快速試紙檢測方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

在利益的驅(qū)動下，使用豬肉冒充牛肉的摻假事件層出不窮，針對肉類的造假和摻假，目前鑒別肉類摻假的檢測方法一般基于PCR技術(shù)，而常規(guī)的PCR檢測需要擴增、電泳及酶切確證三步技術(shù)，從檢樣到報告結(jié)果，至少需要5個小時，缺少現(xiàn)場快速篩選的檢測手段，使得錯檢、漏檢等現(xiàn)象時有發(fā)生，極大地損害了國家利益和消費者利益。因此，發(fā)明一種新型肉類成分快速鑒別方法，是當前的迫切需要。

本發(fā)明利用特異性的豬源性核酸序列結(jié)合金納米粒子，并利用金納米粒子堆積顯色的特性，采用試紙法實現(xiàn)了豬源性成分的快速鑒別，當樣品中含有10%及以上的豬源性成分即可被檢測出來。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的：提供一種豬源性成分摻假的快速試紙鑒別方法，使得現(xiàn)場快速鑒別成為可能。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種豬源成分摻假的快速試紙檢測方法，步驟為：

豬源性成分特異性核酸序列的選擇：

根據(jù)?Genebank公布的豬線粒體基因的保守序列?(GenBank：AF039170.1)，選擇了5’-SH-CAA?CTA?GAT?ACA?TCT?ACA?TGA?TTC?ATT?AC-3’這一能代表豬種屬的特異性序列片段DNA，其中CAA端修飾了巰基。片段長度為29bp，約10nm，該核酸序列DNA及其生物素修飾的互補片段（DNA’）委托生工生物工程(上海)有限公司合成。

（1）結(jié)合豬源性成分特異性核酸序列DNA的金納米粒子探針的制備：

采用表面帶負電的金納米粒子，粒徑為5~30nm，濃度為3nmol/L，金納米粒子的合成方法為檸檬酸三鈉還原法，合成及處理步驟如下：量取100mL??0.1g/L的HAuCl₄溶液加至三角燒瓶，攪拌加熱至沸騰，5?min后快速加入1~5mL??10g/L的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱30min，冷卻后，裝入分子量12000道爾頓的透析袋，用超純水透析2天，期間換水3次。取1mL金納米粒子溶液至1.5mL?EP管，即為3nmol/L濃度的金納米粒子溶液，加入A₂₆₀=0.27即濃度為10μg/mL?的豬肉特異性核酸序列DNA探針10~50μL，振蕩混勻，將EP管置于水浴中溫育，時間為3~24h，水浴溫度為25~60℃，此時核酸片段的巰基通過金硫鍵作用特異性的吸附在金納米粒子表面。?

（2）檢測試紙的制備：將DNA的互補片段DNA’修飾生物素，并按1~10nmol/L的濃度，噴在硝酸纖維素膜上，37℃干燥2h，貼在粘性塑料背板上，并在上下兩端分別貼上玻璃纖維膜和吸收濾紙，裁切成3mm寬度，即為檢測試紙。

（3）樣品中核酸片段的提取和處理

取含有疑似豬肉成分的肉類，剪碎后，準確稱取0.1g置于1.5mL?EP管中，加入1mL組織裂解液（10?mM?Tris-HCl?(pH?7.5),?100?mM?NaCl，10?mM?EDTA，?0.5%?SDS?和0.4?mg/mL?proteinase?K），蓋上蓋子，將EP管置于沸水中煮，時間為10~30min，將EP管于5000rpm離心?10min，吸取上清，上清中加入等體積抽提液（酚:氯仿:異戊醇體積比=25:24:1），混勻，靜置5min，5000rpm離心?10min，吸取上層水相上清液，上清液中加入等體積冰無水乙醇，輕輕搖勻，靜置15min，用吸頭小心吸取析出的DNA’’形成的白色絮狀物，用70%乙醇漂洗2次，加入100μL超純水溶解，將提取的DNA’’樣品進行紫外檢測，確認A₂₆₀/A₂₈₀的數(shù)值在1.8~1.9，并用超純水調(diào)節(jié)DNA’’濃度，使其A₂₆₀=2.7，此時DNA’’濃度約100μg/mL。

（4）豬源成分摻假的快速試紙檢測：