[發明專利]一種豬源成分摻假的快速試紙檢測方法

有效

• 申請號: 201310445819.4
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN103487576A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 王琴;馮永巍;田耀旗
• 申請（專利權）人: 無錫市產品質量監督檢驗中心
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N21/78
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種豬源成分摻假的快速試紙檢測方法，其特征在于步驟為：

（1）結合豬源性成分特異性核酸序列DNA的金納米粒子探針的制備：?

采用粒徑為5~30nm，濃度為3nmol/L，表面帶負電的金納米粒子，用超純水透析，除去合成過程中過量的檸檬酸三鈉分子；取1?mL金納米粒子溶液至1.5mLEP管，即得到3nmol/L濃度的金納米粒子溶液，加入A₂₆₀=0.27即濃度為10μg/mL的豬肉特異性核酸序列DNA?探針?10~50μL，振蕩混勻，將EP管置于水浴中溫育，時間為3~24h，水浴溫度為25~60℃，此時核酸片段的巰基通過金硫鍵作用特異性的吸附在金納米粒子表面；?

DNA：5’-SH-CAA?CTA?GAT?ACA?TCT?ACA?TGA?TTC?ATT?AC-3’；

（2）檢測試紙的制備：將DNA的互補片段DNA’修飾生物素，并按1~10nmol/L的濃度，噴在硝酸纖維素膜上，37℃干燥2h，貼在粘性塑料背板上，并在上下兩端分別貼上玻璃纖維膜和吸收濾紙，裁切成3mm寬度，即為檢測試紙；

（3）樣品中核酸片段的提取和處理：

取含有疑似豬肉成分的肉類，剪碎后，準確稱取0.1g置于1.5mL?EP管中，加入1mL組織裂解液，組織裂解液組成為pH?7.5的10?mM?Tris-HCl、100?mM?NaCl、10?mM?EDTA、0.5%?SDS和0.4?mg/mL?proteinase?K，蓋上蓋子，將EP管置于沸水中煮，時間為10~30min，將EP管于5000rpm離心10min，吸取上清，上清中加入等體積抽提液，抽提液組成為：酚:氯仿:異戊醇體積比=25:24:1，混勻，靜置5min，5000rpm離心?10min，吸取上層水相上清液，上清液中加入等體積冰無水乙醇，輕輕搖勻，靜置15min，用吸頭小心吸取析出的DNA’’形成的白色絮狀物，用70%乙醇漂洗2次，加入100μL超純水溶解，將提取的DNA’’樣品進行紫外檢測，確認A₂₆₀/A₂₈₀的數值在1.8~1.9，并用超純水調節DNA’’濃度，使其A₂₆₀=2.7，此時DNA’’濃度為100μg/mL；

（4）豬源成分摻假的快速試紙檢測：

吸取提取處理得到的DNA’’樣品10~50μL，加至1?mL的金納米粒子探針體系，37℃溫育，時間為5~30min，將試紙條的玻璃纖維膜一端插入探針體系，探針溶液在毛細作用下，開始向試紙條上端流動，如果DNA’’樣品中不含豬肉DNA，則修飾有特異性豬源成分DNA的金納米粒子會與硝酸纖維素膜上的互補DNA’進行特異性結合，出現紅色可見條帶；反之DNA’’樣品中含有豬肉DNA時，則該DNA會與原先吸附在金納米粒子表面的特異性核酸序列DNA進行特異性結合，金納米粒子探針就不會再與試紙條上的互補DNA’發生結合，此時硝酸纖維素膜上就不會出現可見條帶，說明檢測的樣品中含有豬肉DNA，且豬肉占的比例至少為10%。