[發明專利]高爾基體蛋白GP73定量測定試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310444307.6
• 申請日: 2013-09-26
• 公開（公告）號: CN103499692A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 奚偉紅;王布強;王京;嚴子禾;高淑舫;高磊
• 申請（專利權）人: 江蘇福隆生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 江陰市同盛專利事務所(普通合伙) 32210
• 代理人: 唐紉蘭;曾丹

1.一種高爾基體蛋白GP73定量測定試劑盒，包括盒體（1）和盒體上方的盒蓋（2），其特征是：所述盒體（1）內設有微孔板（6）和位于盒體（1）底部的支撐板（3），其中微孔板（6）由48或96個微孔（7）組成，支撐板（3）上開有多個孔（4），所述孔（4）內共放置有八個試劑瓶（5），所述八個試劑瓶（5）內分別含有磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、校準品、質控品、清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液，其中磁分離試劑含有高爾基體蛋白GP73單克隆抗體包被的磁顆粒。

2.一種高爾基體蛋白GP73定量測定檢測方法，其特征在于所述檢測方法包括試劑準備過程和檢測步驟，所述試劑準備過程如下：

步驟一、磁分離試劑的制備

一、磁珠緩沖液配制

（1）、稱取TRIS?4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，然后稱取0.96g?TWEEN-20于20ml容器中加適量水使其完全溶解后，再倒入上述1L容器中；

（2）、用移液器將?Proclin-300量取0.2ml于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述?1L容器中加入?800ml純化水，充分攪拌；

（3）、調節PH計測量其?PH值，控制?PH在7.95-8.05之間；

（4）、稱取BSA?3g倒入上述1L容器中；

（5）、最后1L容器定容至?1000ml，用0.2um濾器過濾；過濾完后貼好標簽于2-8℃冷庫貯存；

二、磁分離試劑的制備

（1）、將1.0mg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ulDMSO中，取2mg抗GP73單克隆抗體溶于PH?9.5的0.1mol/L的PB緩沖液中至總體積為1ml；

（2）、確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到上述GP73單克隆抗體溶液中，置室溫90min；

（3）、然后將抗體溶液加入到Centricon-10濃縮管中，放入到高速冷凍離心機中在3000g下濃縮30min至體積為0.5ml；

（4）、取0.5ml磁珠加入5ml反應杯中，放入專用試管架，經磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；

（5）、每次加入1.5ml?PH9.5的0.1mol/L的PB緩沖液，混勻30秒，上架，去上清，重復操作3次；將獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應4小時；

（6）、加入0.3ml?1mol/L的TRIS溶液?37℃15分鐘；

（7）、每次加入1.5ml?PH7.2的0.1mol/L的PB緩沖液清洗已經標記的磁珠，混勻30秒，上架，去上清，重復操作3次；

（8）、用100ml磁珠保存液將磁珠轉入125ml玻璃瓶，即為?0.05％的GP73磁分離試劑；磁珠保存液配方為0.1％?BSA，0.05％吐溫-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存；

（9）、將獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1:1的比例混勻，即得磁分離試劑；

步驟二、酶反應物的制備

步驟三、反應增強劑的配制

（1）、稱取TRIS1.56g和NaCl?4.23g于1L容器中；用移液器將?Proclin-300量取0.2ml于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述?1L容器中；

（2）、用量筒量取800ml純化水于上述1L容器中，充分攪拌直至完全溶解，然后調PH值，控制PH在?7.35-7.45之間；

（3）、稱取Mak33?0.9g于上述1L容器中；最后定容至1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾；

步驟四、校準品稀釋液的配制

步驟五、校準品和質控品的配制

步驟六、清洗濃縮液的配制

（1）、稱取Kcl?4g、NaCl40g、蔗糖10g于1L容器中；

（2）、稱取0.225g?Tween-20于100ml容器中加15ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

（3）、用移液器將Proclin-300量取0.225ml于盛有15ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

（4）、用量筒量取800ml純化水于上述1L容器中，充分攪拌直至完全溶解；

（5）、調PH，控制其范圍在7.35-7.45之間；

（6）、最后定容至1000ml，完全溶解后用0.2um濾器過濾即得；

步驟七、底物溶液的配制

所述高爾基體蛋白GP73的檢測步驟如下：

（1）、加50μl高爾基體蛋白GP73校準品、質控品、待測標本至對應微孔底部；

（2）、加50μl酶反應物至每一微孔中；

（3）、加50μl反應增強劑至每一微孔中；

（4）、加50μl磁分離試劑至每一微孔中；

（5）、用塑料薄膜覆蓋微孔，多管混勻器輕輕振蕩微孔板30s后，置37℃水浴30分鐘；

（6）、微孔板放至磁分離器上，確保每個微孔都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘；緩慢的倒轉分離器倒出上清液，把倒轉的微孔板連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在微孔上的所有液滴；

（7）、清洗濃縮液用純化水稀釋20倍后，加200μl稀釋后的清洗液至每一微孔中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s；加樣時應避免加樣力度過大而導致磁珠濺出，且混勻要徹底；

（8）、重復步驟（6）、（7）、（6）一遍；

（9）、加100μl底物溶液至微孔中混勻3秒，迅速用準備好的發光檢測儀進行檢測；

（10）、以校準品濃度的Log值為橫坐標，RLU的Log值為縱坐標繪制出標準曲線（雙對數曲線），以各待測血清RLU值在標準曲線上查出該血清的GP73的濃度，其中縱坐標為發光強度，橫坐標為GP73濃度（單位為ng/ml）。

3.根據權利要求2所述的一種高爾基體蛋白GP73定量測定試劑盒及其檢測方法，其特征在于所述底物溶液的制備包括以下步驟：

一、底物溶液A的配制步驟

（1）、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、魯米諾1.0g和對碘苯酚0.1mg于1L燒杯中；

（2）、用量筒量取400ml純化水于1L燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調PH，控制其范圍在7.95-8.05之間；

（3）、用0.2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至500ml，混勻后即得；

二、底物溶液B的配制

（1）、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、過氧化脲0.1g和PC300?250ul于1L燒杯中；

（2）、用量筒量取400ml純化水于1L燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調?PH控制其范圍在7.95-8.05之間；

（3）、用0.2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至500ml，混勻后即得。