[發明專利]高爾基體蛋白GP73定量測定試劑盒及其檢測方法有效

申請號：	201310444307.6	申請日：	2013-09-26
公開（公告）號：	CN103499692A	公開（公告）日：	2014-01-08
發明（設計）人：	奚偉紅;王布強;王京;嚴子禾;高淑舫;高磊	申請（專利權）人：	江蘇福隆生物技術有限公司
主分類號：	G01N33/68	分類號：	G01N33/68;G01N33/531
代理公司：	江陰市同盛專利事務所(普通合伙) 32210	代理人：	唐紉蘭;曾丹
地址：	214434 江蘇省***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	高爾基蛋白 gp73 定量測定試劑盒及其檢測方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及一種高爾基體蛋白GP73定量測定試劑盒及其檢測方法，用于體外定量測定樣品血清中的高爾基體蛋白GP73含量。

背景技術

肝癌發病率在全世界是位列第四位、中國位列第二的惡性腫瘤，且在世界范圍內呈逐年上升趨勢，現總發病率已超過56萬。肝癌發病之初較為隱匿，臨床難以檢出，臨床診斷檢出一般多為晚期，治療效果差，如若早期發現肝癌并且及時治療可以提高患者的5年存活率，因此肝癌的早期發現具有重要的臨床意義。

目前肝癌的檢測手段包括肝超聲影像分析和血清學標志物檢測，其中最常使用的血清學標志物是甲胎蛋白（AFP），但是AFP在早期肝癌診斷中靈敏度不高，只有50％?～60％的肝癌患者AFP呈陽性，并且慢性肝炎、肝硬化患者等肝癌高危人群也可引起甲胎蛋白的升高。因此，臨床需要一種更好地用于肝癌監測的標志物。

近年來，隨著基因組學、蛋白質組學、腫瘤免疫等相關研究的飛速發展，研究者篩選出一些潛在的新的腫瘤標志物，而高爾基體不但參與蛋白加工，還參與細胞分化及細胞間信號的轉導，并在細胞凋亡中扮演重要角色，其功能障礙可能與腫瘤的發生密切相關，其中，高爾基體糖蛋白73（GP73）是最值得期待的血清標志物之一。已經有多個研究組驗證了GP73是一種新的肝癌標志物。在以往的研究中多使用免疫印跡方法，這種方法不僅靈敏度低、特異性弱，在操作上也比較復雜，無法在臨床上普及應用。經專利檢索，GP73的檢測方法有多種包括ELISA、基因診斷等多種形式，但尚未見有將板式磁顆粒化學發光免疫分析技術應用到高爾基體蛋白GP73的檢測中。

發明內容

本發明目的在于提供一種靈敏度高、特異性強、操作簡單的高爾基體蛋白GP73板式磁顆粒化學發光免疫分析測定試劑盒以及制備方法。

本發明的目的是這樣實現的：?

一種高爾基體蛋白GP73板式磁顆粒化學發光免疫分析測定試劑盒，包括盒體和盒體上方的盒蓋，所述盒體內設有微孔板和位于盒體底部的支撐板，其中微孔板由48或96個微孔組成，支撐板上開有多個孔，所述孔內共放置有八個試劑瓶，所述八個試劑瓶內分別含有磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、校準品、質控品、清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液，其中磁分離試劑含有高爾基體蛋白GP73單克隆抗體包被的磁顆粒。

本發明高爾基體蛋白GP73定量測定檢測方法，所述檢測方法包括試劑準備過程和檢測步驟，所述試劑準備過程如下：

步驟一、磁分離試劑的制備

一、磁珠緩沖液配制

（1）、稱取TRIS?4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，然后稱取0.96g?TWEEN-20于20ml容器中加適量水使其完全溶解后，再倒入上述1L容器中；

（2）、用移液器將?Proclin-300量取0.2ml于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述?1L容器中加入?800ml純化水，充分攪拌；

（3）、調節PH計測量其?PH值，控制?PH在7.95-8.05之間；

（4）、稱取BSA?3g倒入上述1L容器中；

（5）、最后1L容器定容至?1000ml，用0.2um濾器過濾；過濾完后貼好標簽于2-8℃冷庫貯存；

二、磁分離試劑的制備

（1）、將1.0mg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ulDMSO中，取2mg抗GP73單克隆抗體溶于PH?9.5的0.1mol/L的PB緩沖液中至總體積為1ml；

（2）、確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到上述GP73單克隆抗體溶液中，置室溫90min；

（3）、然后將抗體溶液加入到Centricon-10濃縮管中，放入到高速冷凍離心機中在3000g下濃縮30min至體積為0.5ml；