[發(fā)明專利]一種利用酸性蛋白酶水解魚(yú)源膠原蛋白制備的抗凍多肽

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310441150.1
• 申請(qǐng)日: 2013-09-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103467587A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪少蕓;蔡茜茜;何慶燕;饒平凡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福州大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/46
• 分類號(hào): C07K14/46;C12P21/06;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抗凍多肽，更具體地涉及了一種利用酸性蛋白酶水解魚(yú)源膠原蛋白制備的抗凍多肽，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

食品和醫(yī)藥產(chǎn)品在低溫儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中由于環(huán)境溫度的波動(dòng)變化而反復(fù)地遭受冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶的問(wèn)題越來(lái)越受到人們的關(guān)注。溫度的反復(fù)升降使冰晶不斷生長(zhǎng)、凍融和重結(jié)晶，嚴(yán)重破壞細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)而失去產(chǎn)品應(yīng)有的品質(zhì)。世界范圍內(nèi)的科學(xué)家正面臨嚴(yán)肅的挑戰(zhàn)：如何控制冰晶生長(zhǎng)及重結(jié)晶，實(shí)現(xiàn)低溫冷鏈上的冰晶生長(zhǎng)控制，是制約眾多食品和醫(yī)藥產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵所在。?

抗凍蛋白,?也稱“冰結(jié)構(gòu)蛋白”，是一類附著在冰晶體表面而抑制冰晶的生長(zhǎng)和重結(jié)晶的活性蛋白質(zhì)。抗凍蛋白由于其具有控制冰晶生長(zhǎng)、減少細(xì)胞損傷及保持產(chǎn)品原有組織結(jié)構(gòu)、質(zhì)地和品質(zhì)的特點(diǎn)和突出意義而成為熱點(diǎn)研究主題。?同樣的研究還表明，抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于局部的特異多肽鏈結(jié)構(gòu)域而并不是整體蛋白質(zhì)在起作用，即使是純化了的抗凍蛋白，抗凍活性往往不高，仍然需要探究其活性域來(lái)進(jìn)一步提高抗凍效率。?所以,如何獲得食品源的結(jié)構(gòu)緊湊的高活性抗凍多肽，就成為抗凍蛋白迫切的研究方向。?

??

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種利用酸性蛋白酶水解魚(yú)源膠原蛋白制備的抗凍多肽，使抗凍活性得以高效地實(shí)現(xiàn)。?

本發(fā)明的一種利用酸性蛋白酶水解魚(yú)源膠原蛋白制備的抗凍多肽，是由11個(gè)氨基酸所構(gòu)成的多肽。所述多肽的氨基酸序列為：GAIGPAGPLGP。?

所述抗凍多肽的制備方法如下：?

以包括來(lái)自魚(yú)皮、魚(yú)鱗的魚(yú)源膠原蛋白為原料，采用酸性蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，分離純化、冷凍干燥得到抗凍多肽。

其中，酶解條件為：?pH為5.4、溫度是37℃、酶解時(shí)間為30分鐘、酶-底物配比為1:15（w/w）。?

所述分離純化的具體步驟為：酶解產(chǎn)物首先利用Sephadex?G-50凝膠色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進(jìn)行測(cè)量；收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex?C-25陽(yáng)離子交換色譜進(jìn)行分離，洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0.5?M的0.01mol/L?pH7.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min；收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10%-90%?（v/v）乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為1mL/min，收集20%乙腈和80%水（v/v）處的洗脫峰,得到抗凍多肽。?

為了實(shí)現(xiàn)上述方案，本發(fā)明采取的具體步驟如下：?

(1)???????明膠酶解條件的優(yōu)化

本技術(shù)所采用的酶和魚(yú)（魚(yú)皮、魚(yú)鱗）膠原蛋白購(gòu)自Sigma生物試劑公司（中國(guó)·上海）。采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)三個(gè)酶解因素即酶解溫度（37℃，45℃和50℃）、酶解時(shí)間（10，20，30，40和60分鐘）以及酶-底物配比（1:100,1:50,1:20,1:15和1:10?w/w），進(jìn)行考察。稱取1.65克魚(yú)源膠原蛋白溶解于6ml?Mili-Q水中，然后用2mol/L?HCL將其pH調(diào)節(jié)至5.4。先將該溶液水浴加熱到需要溫度，接著再按不同的酶-底物配比加入相應(yīng)量的酶，按照預(yù)定的反應(yīng)時(shí)間開(kāi)始反應(yīng)。接著再在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再1000rpm離心10分鐘。上清液收集后，分別對(duì)其抗凍活性進(jìn)行測(cè)定，以確定最佳酶解條件。

得到具有最大抗凍活性的酶解液的酶解條件是：?pH為5.4、溫度是37℃、酶解時(shí)間為30分鐘、酶-底物配比為1:15-1:20（w/w）。?

(2)???????酶解產(chǎn)物的分離、純化?

先在最佳酶解條件下進(jìn)行酶解，得到的酶解產(chǎn)物先經(jīng)過(guò)Sephadex?G-50凝膠色譜（長(zhǎng)100cm，直徑2.6cm）進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進(jìn)行測(cè)量。收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex?C-25陽(yáng)離子交換色譜（長(zhǎng)55cm，直徑2.0cm）進(jìn)行分離，洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0.5?M的0.01mol/L?pH7.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min。收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%?乙腈溶液作為洗脫液，流速為1mL/min，得到高純度的特異性抗凍多肽。

(3)???????抗凍活性的測(cè)試?