[發明專利]卵巢癌特異的腫瘤抗原肽及其制備方法

在審

• 申請號: 201310439063.2
• 申請日: 2013-09-24
• 公開（公告）號: CN103739667A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 施煒星;楊春霞;房永生
• 申請（專利權）人: 上海宇研生物技術有限公司
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06
• 代理公司: 上海三方專利事務所 31127
• 代理人: 吳干權

1.一種卵巢癌特異的腫瘤抗原肽的制備方法，其特征在于由以下步驟組成：

i.將細胞HTB161A2在RPMI補充性培養基中貼壁培養，培養基中加入10%胎牛血清，將細胞的濃度調節在0.5×10⁶個/ml；

ii.倒去培養液，用預冷的1×PBS緩沖液洗細胞3次，用3ml細胞裂解緩沖液將裂解液沖洗和收集細胞，且在4℃下旋轉反應1小時。懸液以高速15Krpm，20分鐘下離心，收集上清液保存在-80℃備用；

iii.收集0.5ml磁珠子并用包被緩沖液洗4次；

iv.將磁珠子與0.42ml，4.8mg/ml的BB7.2抗體孵育,加2.08ml，3M的(NH₄)₂SO₄，在3.26ml包被緩沖液中室溫孵育72小時；

v.用磁力集中器移走上清液，磁珠子里加入相同體積的含0.5%BSA與0.05%Tween20的PBS并在室溫中再孵育48小時；

vi.用0.1%BSA和0.05%Tween20的PBS清洗磁珠子，將磁珠子重懸在2ml含有0.02%疊氮化鈉的PBS中備用；

vii.1×10⁹個在裂解液中的卵巢癌細胞，以100,000×g，離心1小時，丟棄沉淀，將上清用0.22-μm過濾器過濾后與BB7.2抗體連接的磁珠子在4℃旋轉孵育24小時，裝柱后用50ml洗液洗4遍；

viii.將洗后的珠子用2ml10%的HAC洗脫BB7.2抗體連接的磁珠子；

ix.洗脫下的物質收集在離心管中，加10%HAC后煮沸5分鐘；

x.把洗脫下的物質轉移到預濕的孔徑為5kDa的Ultrafree-CL膜上，3500×g在4℃離心5小時，收集濾出液，所述的濾出液即為抗原肽的溶液。

2.如權利要求1所述的卵巢癌特異的腫瘤抗原肽的制備方法，其特征在于所述的細胞裂解緩沖液為pH8.0的50mMTris，150mMNaCl，1%CHAPS，5uMEDTA，0.2%疊氮化鈉，17.4μg/ml?PMSF，蛋白酶抑制劑。

3.如權利要求1所述的卵巢癌特異的腫瘤抗原肽的制備方法，其特征在于所述的BB7.2通過雜交瘤細胞株的培養上清純化而來。

4.一種用權利要求1所述制備方法制備的抗原肽，其特征在于蛋白質序列如下：

FLYDDNQRV。

5.一種用權利要求1所述制備方法制備的抗原肽，其特征在于蛋白質序列如下：

ALMEQQHYV。

6.一種用權利要求1所述制備方法制備的抗原肽，其特征在于蛋白質序列如下：

NLTISDVSV。

7.一種用權利要求1所述制備方法制備的抗原肽，其特征在于蛋白質序列如下：

GVYDGEEHSV。

8.一種用權利要求1所述制備方法制備的抗原肽，其特征在于蛋白質序列如下：

KLQELNYNL。

9.一種用權利要求1所述制備方法制備的抗原肽，其特征在于蛋白質序列如下：

NLMEQPIKV。

10.一種用權利要求1所述制備方法制備的抗原肽，其特征在于蛋白質序列如下：

FLAEDALNTV。