[發明專利]一種在犬細胞中檢測流感病毒RNA聚合酶活性的報告基因質粒及其應用

無效

• 申請號: 201310438794.5
• 申請日: 2013-09-24
• 公開（公告）號: CN103497960A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 孫怡朋;劉金華;劉林青
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12Q1/68;C12Q1/66;C12Q1/42;C12Q1/48;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種在犬細胞中檢測流感病毒RNA聚合酶活性的報告基因質粒及其應用。

背景技術

犬流感是由犬流感病毒引起的犬的高度接觸性傳染病?；既憩F出咳嗽、肺炎等感冒癥狀。近年來，犬流感病毒感染的報道迅速增多，犬是人類重要的伴侶動物，犬的健康越來越受到人們的重視。此外，犬中的流感病毒可能通過人-犬的親密接觸而增加感染人的機會。因此，犬流感病毒不僅影響犬的健康，也對公共衛生安全構成了嚴重威脅。

流感病毒的聚合酶基因在其致病性、宿主適應性及跨種間傳播等多個生物學特性方面有重要作用。有研究發現，較高的聚合酶活性是產生高致病性毒株的一個重要決定因子，病毒聚合酶活性增強，致病性伴隨著增強；更有報道，某些聚合酶基因影響著病毒在人群中的傳播能力。另外，聚合酶活性在一定程度上也能反映RNP各基因片段之間的兼容程度。有研究證明限制病毒重排的一個關鍵因素是RNP復合體的兼容性，而其RNP的兼容性正與其相應的聚合酶活性相關。所以，流感病毒的聚合酶基因對這些生物學特性的影響與聚合酶活性有很大的關系，聚合酶活性對病毒的產生和復制能力有重要影響。

傳統的流感病毒聚合酶活性測定是采用雙報告基因檢測系統，報告基因分別是海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶，由于海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶不能分泌到細胞外，需要裂解細胞以測定熒光素酶的表達量，操作不方便；另外，以往用的報告基因質粒上多是人源啟動子，無法準確的反應病毒聚合酶在犬細胞上的聚合酶活性。

發明內容

本發明的目的是提供一種在犬細胞中檢測流感病毒RNA聚合酶活性的報告基因質粒及其應用。

本發明提供的一種質粒，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

上述質粒在制備檢測病毒RNA聚合酶活性的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍。

上述應用中，所述的病毒為流感病毒。

上述任一所述的應用中，所述流感病毒為豬流感病毒、禽流感病毒和/或人流感

上述任一所述的應用中，所述豬流感病毒為豬H1N2流感病毒，所述禽流感病毒為禽H9N2流感病毒，所述人流感病毒為人H1N1流感病毒。

上述任一所述的應用中，所述檢測病毒RNA聚合酶活性為檢測所述病毒的RNA聚合酶在犬細胞中的RNA聚合酶活性。

上述任一所述的應用中，所述犬細胞為犬MDCK細胞。

一種用于檢測病毒RNA聚合酶活性的試劑盒也屬于本發明的保護范圍，該試劑盒包括上述質粒、內參質粒pCMV/SEAP、犬細胞、分別連接待測病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待測病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待測病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待測病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重組表達質粒。

上述試劑盒中，所述分別連接待測病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待測病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待測病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待測病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重組表達質粒，是將所述待測病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待測病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待測病毒RNA聚合酶中NP蛋白或待測病毒RNA聚合酶中PB2蛋白的基因分別插入pcDNA3.1(+)的多克隆位點得到的；

所述犬細胞為犬MDCK細胞。

上述任一所述的試劑盒中，所述試劑盒還包括檢測Gaussia熒光素酶活性的產品和檢測分泌型堿性磷酸酶活性的產品。

一種檢測待測病毒RNA聚合酶在犬細胞中RNA聚合酶活性的方法也屬于本發明的保護范圍，該方法是利用上述任一所述的試劑盒進行檢測的，包括如下步驟：

將上述質粒、內參質粒pCMV/SEAP、分別連接待測病毒A的RNA聚合酶中PB1蛋白、待測病毒A的RNA聚合酶中PA蛋白、待測病毒A的RNA聚合酶中NP蛋白和待測病毒A的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重組表達質粒共同轉入所述犬細胞中，培養36小時，收集細胞培養液上清，檢測細胞培養液上清中Gaussia熒光素酶活性和堿性磷酸酶活性，計算Gaussia熒光素酶活性和堿性磷酸酶活性的比值，記作a；

將上述質粒、內參質粒pCMV/SEAP、分別連接待測病毒B的RNA聚合酶中PB1蛋白、待測病毒B的RNA聚合酶中PA蛋白、待測病毒B的RNA聚合酶中NP蛋白和待測病毒B的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重組表達質粒共同轉入所述犬細胞中，培養36小時，收集細胞培養液上清，檢測細胞培養液上清中Gaussia熒光素酶活性和堿性磷酸酶活性，計算Gaussia熒光素酶活性和堿性磷酸酶活性的比值，記作b；