[發明專利]一種在犬細胞中檢測流感病毒RNA聚合酶活性的報告基因質粒及其應用

無效

• 申請號: 201310438794.5
• 申請日: 2013-09-24
• 公開（公告）號: CN103497960A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 孫怡朋;劉金華;劉林青
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12Q1/68;C12Q1/66;C12Q1/42;C12Q1/48;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.一種質粒，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

2.權利要求1所述的質粒在制備檢測病毒RNA聚合酶活性的產品中的應用。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于：所述的病毒為流感病毒。

4.根據權利要求2或3所述的應用，其特征在于：所述流感病毒為豬流感病毒、禽流感病毒和/或人流感病毒。

5.根據權利要求2-4任一所述的應用，其特征在于：所述豬流感病毒為豬H1N2流感病毒，所述禽流感病毒為禽H9N2流感病毒，所述人流感病毒為人H1N1流感病毒。

6.根據權利要求2-5任一所述的應用，其特征在于：所述檢測病毒RNA聚合酶活性為檢測所述病毒的RNA聚合酶在犬細胞中的RNA聚合酶活性。

7.一種用于檢測病毒RNA聚合酶活性的試劑盒，包括權利要求1所述的質粒、內參質粒pCMV/SEAP、犬細胞、分別連接待測病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待測病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待測病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待測病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重組表達質粒。

8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于：所述分別連接待測病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待測病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待測病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待測病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重組表達質粒，是將所述待測病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待測病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待測病毒RNA聚合酶中NP蛋白或待測病毒RNA聚合酶中PB2蛋白的基因分別插入pcDNA3.1(+)的多克隆位點得到的；

所述犬細胞為犬MDCK細胞。

9.根據權利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括檢測Gaussia熒光素酶活性的產品和檢測分泌型堿性磷酸酶活性的產品。

10.一種檢測待測病毒RNA聚合酶在犬細胞中RNA聚合酶活性的方法，是利用權利要求7-9中任一所述的試劑盒進行檢測的，包括如下步驟：

將權利要求1所述的質粒、內參質粒pCMV/SEAP、分別連接待測病毒A的RNA聚合酶中PB1蛋白、待測病毒A的RNA聚合酶中PA蛋白、待測病毒A的RNA聚合酶中NP蛋白和待測病毒A的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重組表達質粒共同轉入所述犬細胞中，培養36小時，收集細胞培養液上清，檢測細胞培養液上清中Gaussia熒光素酶活性和堿性磷酸酶活性，計算Gaussia熒光素酶活性和堿性磷酸酶活性的比值，記作a；

將權利要求1所述的質粒、內參質粒pCMV/SEAP、分別連接待測病毒B的RNA聚合酶中PB1蛋白、待測病毒B的RNA聚合酶中PA蛋白、待測病毒B的RNA聚合酶中NP蛋白和待測病毒B的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重組表達質粒共同轉入所述犬細胞中，培養36小時，收集細胞培養液上清，檢測細胞培養液上清中Gaussia熒光素酶活性和堿性磷酸酶活性，計算Gaussia熒光素酶活性和堿性磷酸酶活性的比值，記作b；

將權利要求1所述的質粒、內參質粒pCMV/SEAP共同轉入所述犬細胞中，培養36小時，收集細胞培養液上清，檢測細胞培養液上清中Gaussia熒光素酶活性和堿性磷酸酶活性，計算Gaussia熒光素酶活性和堿性磷酸酶活性的比值，記作對照比值；

若a顯著大于對照比值，則判定所述待測病毒A的RNA聚合酶在犬細胞中具有RNA聚合酶活性；

若a和b顯著大于對照比值，并且a顯著大于b，則判定病毒A在犬細胞中的RNA聚合酶活性大于病毒B在犬細胞中的RNA聚合酶活性；

所述待測病毒為流感病毒。