[發(fā)明專利]以誘導(dǎo)獨一味種子萌發(fā)幼苗為外植體的組織培養(yǎng)試管苗獲得方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310436768.9
• 申請日: 2013-09-23
• 公開（公告）號: CN103444551A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張玨;牟蘭;楊軼浠;尹歡;何詩虹;郭翠平;阮利霞
• 申請（專利權(quán)）人: 成都大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種獨一味組織培養(yǎng)獲得試管苗的方法，特別是涉及一種以獨一味種子誘導(dǎo)苗為外植體的組織培養(yǎng)試管苗獲得方法。

背景技術(shù)

獨一味Lamiophlomis?rotata(Benth.)Kudo，為唇形科，獨一味屬植物，該屬僅有獨一味一個種。主產(chǎn)西藏，青海，甘肅，四川西部及云南西北部；生于高原或高山上強度風(fēng)化的碎石灘中或石質(zhì)高山草甸、河灘地，海拔2700-4500米。具有典型高山植物特征，如植物矮，莖短，根系發(fā)達，葉片較大，貼地展開。這些特征與其生長環(huán)境為高寒缺氧、干旱風(fēng)大、輻射強及晝夜溫差大等有關(guān)。

獨一味屬于傳統(tǒng)藏藥，民間用全草入藥，治跌打損傷、筋骨疼痛、氣滯閃腰、浮腫后流黃水、關(guān)節(jié)積黃水、骨松質(zhì)發(fā)炎。此外據(jù)青海對大白鼠股動脈、肱動脈、頸動脈橫切斷止血試驗，認為本種有較好的止血效果。隨著野生獨一味的存儲量逐步降低，對獨一味的研究也越來越受到重視。對將獨一味引種到低海拔地區(qū)的研究工作也有部分開展。如金蘭等通過將獨一味根莖芽從海拔4300m的野生地移栽到海拔2366m和3100m的實驗基地后，對移栽地獨一味的花粉活力，花粉萌發(fā)及自然結(jié)束率進行了統(tǒng)計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)獨一味移栽到較低海拔后花粉活力低，柱頭上無花粉萌發(fā)，自然結(jié)實率為0。因此，在低海拔地區(qū)對獨一味的種苗獲得，以植物組織培養(yǎng)方式更為可行。然后，獨一味成株莖短，約1cm，葉片大，具皺，密布絨毛。這些特征使采用獨一味成株為外植體時，滅菌獲得無菌苗難度很大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種以誘導(dǎo)獨一味種子萌發(fā)幼苗為外植體的獨一味組織培養(yǎng)試管苗獲得方法。

為達到上述目的，本發(fā)明采用的解決方法包括下列步驟：

（1）選取當(dāng)年收獲健康飽滿，具有活力的獨一味種子，播種于浸有GA₃?50mg·L^-1的濾紙上進行催芽，待幼苗長至約1cm后,，噴施一次800倍液的多菌靈進行植株的表面消毒殺菌預(yù)處理，然后收集幼苗。

（2）先將作為外植體的獨一味幼苗用800倍多菌靈溶液侵泡30min，再用自來水沖洗1h左右，，放入超凈工作臺內(nèi)用濃度為75%的酒精消毒10s，無菌水沖洗3次，接著用濃度為0.1%的升汞消毒5min，最后用無菌水震蕩洗4～6次，用無菌濾紙吸干幼苗表面的水分備用；

（3）在無菌條件下用手術(shù)刀在獨一味幼苗上劃出傷口，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+6-BA?0.5mg.L-1+NAA?1.0mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂4.8g·L^-1中進行愈傷組織誘導(dǎo)，所采用的pH值為6.0，培養(yǎng)溫度20℃、光照時數(shù)10h/d、光照強度為1000～1500Lx，培養(yǎng)時間30d；

（4）30d后，選取顏色黃綠、有瘤狀突起質(zhì)地良好的愈傷組織作為外植體，接入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA?1.0～3.0mg·+NAA?0.1～3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂4.8g·L^-1中進行叢生芽的誘導(dǎo)，所采用的培養(yǎng)基pH值為6.0，培養(yǎng)溫度為20℃、光照時數(shù)12h/d、光照強度為1200～1800Lx，培養(yǎng)35d后，愈傷組織誘導(dǎo)分化出大量叢生芽。

（5）根的誘導(dǎo)培養(yǎng)，待叢生芽長至2cm時，將叢生芽分成單芽，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基：1/2MS+IBA?0.5mg·L^-1+NAA?0.1mg·L^-1+蔗糖15g·L^-1+瓊脂4.8g·L^-1，中誘導(dǎo)生根20d后,待不定根長至2-3cm時，即可移至高海拔地區(qū)溫室大棚內(nèi)進行煉苗移栽。

采用上述方案，本發(fā)明以種子萌發(fā)苗為外植體，可以有效的降低外植體接種后的污染率，快速在低海拔地區(qū)獲得獨一味組織胚芽試管苗。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。

實施例1

（1）選取飽滿、有生命力的獨一味種子，用清水清洗后，陰干。放入浸透50g·L^-1GA3的濾紙上，20℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)萌發(fā)直到胚根和胚芽突破種皮長出，平均萌發(fā)率31.4%。長出后第4d，開始每日用800倍多菌靈噴施到平皿，連續(xù)噴施4d后，收集幼苗，用自來水沖洗干凈，然后陰干，再在超凈臺用濃度為75%的酒精消毒15s，接著用濃度為0.1%的升汞消毒5min，最后用無菌水震蕩洗5次，洗后用已滅菌的濾紙反復(fù)吸干幼苗表面的水分；