[發明專利]鴨IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒及使用方法

有效

• 申請號: 201310432585.X
• 申請日: 2013-09-13
• 公開（公告）號: CN103497886A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 李慧芳;朱文奇;張靜;宋衛濤;胡艷;宋遲;束婧婷;朱春紅;陶志云;徐文娟;善艷菊
• 申請（專利權）人: 江蘇省家禽科學研究所
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及一種鴨IGF-I和IGF-I?R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒及使用方法。?

背景技術

我國是世界上最大的水禽生產國和消費國，但是我國水禽業整體生產水平不高，競爭力不強，水禽領域的技術很薄弱、可供利用的科學研究成果很少，特別是有關鴨肌肉生長發育分子技術方面的研究成果極少，因此，要想在短期內快速有效地提高我國鴨業生產水平，就必須借助先進的分子生物學的技術和成果，加快我國鴨業的發展。?

MCF-PCR技術是一種經濟、較高通量、準確的多基因表達分析技術，該技術基于競爭性PCR原理，結合熒光通用引物和多重嵌合特異引物使用，實現多重PCR擴增以及毛細管電泳長度差異片段分離，對多個目標基因及參照基因進行同時定量，最后以參照基因校正即可獲取目標基因的相對表達量。目前已經廣泛應用于人類和動物基因表達檢測研究。國內外大量的研究報道，IGF-I和IGF-I?R基因在鴨生長發育調控過程中起重要作用。IGF-I和IGF-1R基因在組織中表達量的準確分析對IGF-I和IGF-I?R基因的功能揭示和應用都有顯著的科學和現實意義。?

發明內容

本發明的目的在于克服上述技術存在的缺陷，提供一種鴨IGF-I和IGF-I?R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒及使用方法，將設計獨特、穩定和高效的試劑盒與MCF-PCR技術結合，是一種可靠、便捷、價格低廉的檢測方法。?

其具體技術方案為：?

一種鴨IGF-I和IGF-I?R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒，包括盒體和隔離墊，還包括IGF-I基因嵌合特異上下游引物、IGF-I?R基因嵌合特異上下游引物、參照基因ACTB基因嵌合特異上下游引物、IGF-I基因內對照DNA、IGF-I?R基因內對照DNA、Tag酶DNA連接酶。?

一種本發明所述的鴨IGF-I和IGF-I?R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒及使用方法，其特征在于，包括以下步驟：?

1)引物設計?

通用引物的設計：?

設計原則保證上下游引物的TM值≤58℃，為了避免通用引物帶來非特異產物，通用引物的長度為18bp，上游通用引物5’端用Fam熒光標記；?

嵌合特異引物的設計：?

根據GenBank數據庫中目標基因IGF-I和IGF-I?R及參照基因ACTB基因的cDNA序列信息，設計了3對20～26bp長的序列作為嵌合特異引物，TM值≥61℃，擴增產物長度在200～310bp之間，相鄰產物長度的差大于10bp，之后與通用引物組成嵌合特異引物，且在通用引物的3’端插入ct兩個堿基，引物經Blast和Oligo?mask軟件分析，確保特異性擴增；?

IGF-I基因嵌合特異上下游引物P1和P2、IGF-I?R基因嵌合特異上下游引物P3和P4、參照基因ACTB基因嵌合特異上下游引物P5和P6，P1～P6六條引物詳細信息如下，每條引物中小寫ct前是通用引物，小寫ct后為特異引物：?

IGF-I基因嵌合特異上游引物P1表示的信息為：?

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctCTGGTTGATGCTCTTCAGTTCGTAT-3’?

IGF-I基因嵌合特異下游引物P2表示的信息為：?

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctTGCAGACTTAGGTGGCTTTATTGGA-3’?

IGF-I?R基因嵌合特異上游引物P3表示的信息為：?

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctTTCAGGAACCAAAGGGCGACA-3’?

IGF-I?R基因嵌合特異下游引物P4表示的信息為：?

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctCAACATCAACCATATTCCAGCTATTG-3’?

參照基因ACTB嵌合特異上游引物P5表示的信息為：?

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’?

參照基因ACTB嵌合特異下游引物P6表示的信息為：?

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctAGTCAAGCGCCAAAAGAAAA-3’；?

2)合成內對照DNA片段?