[發明專利]鴨IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒及使用方法

有效

• 申請號: 201310432585.X
• 申請日: 2013-09-13
• 公開（公告）號: CN103497886A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 李慧芳;朱文奇;張靜;宋衛濤;胡艷;宋遲;束婧婷;朱春紅;陶志云;徐文娟;善艷菊
• 申請（專利權）人: 江蘇省家禽科學研究所
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種鴨IGF-I和IGF-I?R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒，其特征在于，包括盒體(1)和隔離墊(2)，還包括IGF-I基因嵌合特異上下游引物(3)、IGF-I?R基因嵌合特異上下游引物(4)、參照基因ACTB基因嵌合特異上下游引物(5)、IGF-I基因內對照DNA(6)、IGF-I?R基因內對照DNA(7)、Tag酶DNA連接酶(8)。

2.一種權利要求1所述的鴨IGF-I和IGF-I?R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

7)引物設計

通用引物的設計：

設計原則保證上下游引物的TM值≤58℃，通用引物的長度為18bp，上游通用引物5’端用Fam熒光標記；

嵌合特異引物的設計：

根據GenBank數據庫中目標基因IGF-I和IGF-I?R及參照基因ACTB基因的cDNA序列信息，設計了3對20～26bp長的序列作為嵌合特異引物，TM值≥61℃，擴增產物長度在200～310bp之間，相鄰產物長度的差大于10bp，之后與通用引物組成嵌合特異引物，且在通用引物的3’端插入ct兩個堿基，引物經Blast和Oligo?mask軟件分析，確保特異性擴增；

IGF-I基因嵌合特異上下游引物P1和P2、IGF-I?R基因嵌合特異上下游引物P3和P4、參照基因ACTB基因嵌合特異上下游引物P5和P6，P1～P6六條引物詳細信息如下，每條引物中小寫ct前是通用引物，小寫ct后為特異引物：

IGF-I基因嵌合特異上游引物P1表示的信息為：

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctCTGGTTGATGCTCTTCAGTTCGTAT-3’

IGF-I基因嵌合特異下游引物P2表示的信息為：

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctTGCAGACTTAGGTGGCTTTATTGGA-3’

IGF-I?R基因嵌合特異上游引物P3表示的信息為：

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctTTCAGGAACCAAAGGGCGACA-3’

IGF-I?R基因嵌合特異下游引物P4表示的信息為：

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctCAACATCAACCATATTCCAGCTATTG-3’

參照基因ACTB嵌合特異上游引物P5表示的信息為：

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’

參照基因ACTB嵌合特異下游引物P6表示的信息為：

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctAGTCAAGCGCCAAAAGAAAA-3’；

8)合成內對照DNA片段

針對IGF-I和IGF-I?R基因和參照基因ACTB的擴增片段，合成與對應引物擴增序列相比插入3bp堿基的DNA片段為內對照序列，并進行精確定量，配制內對照DNA混合液，梯度稀釋至10³～10⁴個分子／μl；

9)多重競爭性PCR反應

a)肝臟總RNA提取按TRNzol-A⁺總RNA提取試劑盒(DP421)的說明書進行，RNA樣品經1.4％瓊脂糖-甲醛變性凝膠電泳和紫外分光光度計檢測，OD_260／2801.8～2.0，保證RNA樣品質量可靠，均一化RNA濃度至1μg／μl，取1μg總RNA，cDNA第1鏈的合成按照反轉錄試劑盒QuantScript?RT?Kit，KRl03-04的使用說明書進行；

b)配制PCR引物混合液，含3對0.5μM的嵌合特異引物P1、P2；P3、P4和P5、P6，20μM的通用引物，兩者等比例混合；

c)多重PCR反應體系10×GT?Buffer含34mM?Mg²⁺1.5μl，100mM?Mg²⁺0.09μl，dNTP?mix各2.5mM3μl，Primers引物混合物3μl，Taq?DNA?Polymerase5units／μl0.75μl，Templates?cDNA1.5μl，BSA10mg／ml0.21μl，內對照DNA1ul，DEPC?H₂O補水至15μl，反應過程為94℃2min，94℃30s，62℃90s，65℃1min，20cycles；94℃2min，94℃30s，53℃90s，68℃1m，68℃20min，18cycles；

d)取1μl?PCR產物，加入8.6μl的Hi-Di和0.4μl的DNA分子標準，上述混合物95℃，變性5min，然后迅速冰水浴2min，離心后用ABI測序儀3730檢測，電泳結果經GeneScan?Analysis3.0和GeneMapper?ID?software?v3.2軟件分析獲得每個基因位點的樣本條帶／內對照條帶大小、峰高、峰面積的數據，產物大小由DNA分子標準得出，峰高或峰面積用于判斷PCR產物的量；

4)數據分析

a)計算每個基因位點的比值S／內對照DNA條帶I的熒光峰高或峰面積之比S／I；

b)將每個目標基因位點的比值S／I分別除以參照基因的比值S／I即獲得樣本目標基因的相對表達量。