[發明專利]重組Ⅱ型豬圓環病毒的衣殼蛋白噬菌體展示顆粒及其制備方法與應用

無效

• 申請號: 201310432346.4
• 申請日: 2013-09-22
• 公開（公告）號: CN103540605A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 楊柳;沈克飛;鄭華;張邑帆;付利芝;谷山林;熊仲良
• 申請（專利權）人: 重慶市畜牧科學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N7/01;C12N15/34;C12N15/66;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/92
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 秦力軍

技術領域

本發明屬于生物領域，特別涉及重組豬圓環病毒PCV2-Cap/Phage展示顆粒的制備和運用。

背景技術

豬圓環病毒（Porcine?circovirus，PCV）為Tischer（1974）在PK-15細胞系中發現的一種無囊膜、無CPE的細胞污染物；于1982年鑒定為單股環狀DNA病毒。它是目前發現的最小的一種脊椎動物病毒，分類上屬于圓環病毒科圓環病毒屬。豬圓環病毒分為不致病豬圓環病毒1型（PCV1）及致病性豬圓環病毒2型（PCV2，下同）兩種病毒。

豬圓環病毒病（PCVD）是由PCV2病毒引起的斷奶豬多系統衰竭綜合征（Post?weaning?systemic?wasting?syndrome，PMWS）是公認的危害全球養豬業的重大經濟影響性疾病，同時也是我國養豬業繼豬瘟和藍耳病之后的第三大傳染病。PCV2急性感染損害豬免疫系統，造成免疫系統紊亂，產生免疫抑制，使機體免疫力下降，最終導致死亡率急劇上升。同時PCV2可與其他多種病原混合感染、大大降低豬場生產成績。目前，我國絕大多數豬場的豬群均已感染豬圓環病毒。豬圓環病毒病可能給豬場帶來嚴重的經濟損失，其導致的直接經濟影響主要表現為：豬群保育期和生長育肥期的高死亡率，以及受疾病影響，豬出欄重無法達到要求等；間接經濟影響則包括：豬場為控制細菌混合感染而不得不增加抗生素用量，改變豬場管理辦法，以盡可能減少疾病發生，增加養豬的成本等。

PCV2基因組為單股環狀負鏈DNA，全長1768bp或1767bp。已有的資料顯示，PCV2的基因組共編碼11個開放閱讀框（Open?reading?frames，ORF），其中主要的閱讀框為ORF1和ORF2。ORF1功能是與病毒的復制轉錄有關（Mankertz?et?al.1998），為最大的閱讀框；ORF2的功能是編碼病毒的衣殼（Cap）蛋白，共有702bp核苷酸，位于基因組的互補鏈上，編碼233個氨基酸。Cap蛋白的N-端65～87aa、113～147aa、157～183aa區域及C端的4個氨基酸為病毒的主要抗原位點。其中的N端69～83aa和117～131aa兩個抗原位點具有針對PCV2型特異性；能被PCV2多抗所識別，N端157～183aa抗原位點為PCV1和PCV2共同具有。盡管PCV1和PCV2的Cap蛋白存在一個共同的抗原位點，但血清學實驗顯示兩種血清型的Cap蛋白之間不存在抗原交叉性。Cap蛋白是PCV2病毒粒子的結構蛋白，具有良好的免疫原性，能誘導產生較強的抗體反應，是構建重組疫苗和臨床檢測的首選抗原。因此，大量地生產Cap蛋白是將其應用于疫苗研制中急需克服的問題。

有效疫苗免疫是預防和控制豬圓環病毒感染的關鍵。疫苗免疫通過特異性地刺激機體的免疫系統，產生抗病毒抗體、細胞免疫力以及免疫記憶，以清除病毒。利用傳統的豬腎細胞培養技術生產圓環病毒滅活疫苗，病毒效價低，抗原含量不足，產量低。目前，國內豬圓環病毒II型（PCV2）滅活疫苗產量低，價格高，限制了該類產品的推廣和應用。盡管國外已有上市的亞單位疫苗，能夠顯著地降低病毒學癥，但價格昂貴。此外，關于使用酵母和桿狀病毒表達ORF2蛋白的報道，但酵母表達系統繁瑣，存在蛋白切割的問題，桿狀病毒則存在表達成本高，蛋白純化困難等缺點。

本發明是基于上述現有技術，并針對現有技術的不足進行改進發明的。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供重組Ⅱ型豬圓環病毒的衣殼蛋白噬菌體（以下簡稱PCV2-Cap/Phage）的展示顆粒及其制備方法，以及制備重組PCV2-Cap/Phage展示顆粒所需的關鍵基因、重組質粒等。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

PCV2-Cap蛋白（Ⅱ型豬圓環病毒的衣殼蛋白的簡稱）在制備重組PCV2-Cap/Phage展示顆粒中的應用，所述CV2-Cap蛋白的氨基酸序列以如SEQID?NO:4所示的氨基酸序列。

如SEQ?ID?NO:4所示的氨基酸序列如下：