[發(fā)明專利]利用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測華法林個體化用藥相關(guān)基因多態(tài)性的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310431123.6
• 申請日: 2013-09-22
• 公開（公告）號: CN103525911A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳迪;傅詠南;張奕;王校;毛丹丹;卞雪蓮
• 申請（專利權(quán)）人: 上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及華法林個體化用藥相關(guān)基因多態(tài)性的檢測方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

華法林是臨床上常用的抗凝藥物，通過抑制凝血因子的活化抑制新的血栓形成，限制血栓的擴大和延展，抑制血栓脫落和栓塞的發(fā)生,有利于血栓的清除。臨床上主要用于治療房顫、心瓣膜修復(fù)術(shù)、再發(fā)性的中風(fēng)、深靜脈血栓以及肺動脈栓塞。華法林藥理學(xué)作用比較復(fù)雜，即使很小的劑量-反應(yīng)變化也可能導(dǎo)致血栓或出血。臨床用藥劑量可以相差20倍左右，如何正確使用華法林，合理監(jiān)測調(diào)整劑量，已成為困擾臨床醫(yī)生的難題。華法林主要由肝細(xì)胞微粒體細(xì)胞色素P450?2C9酶羥基化后，由腎臟排出體外。另一方面華法林通過抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶，阻止維生素K還原形式KH2的形成。KH2通過對維生素K依賴性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ氨基末端谷氨酸殘基的γ-羧化作用，使其具有生物活性，促進(jìn)凝血因子結(jié)合于磷脂表面，加速凝血過程。研究發(fā)現(xiàn)CYP2C9和VKORC1是華法林代謝個體差異最主要的兩個遺傳學(xué)方面的影響因素，其基因多態(tài)性變量約占香豆素類藥初始劑量和維持劑量的35%～50%。

細(xì)胞色素氧化酶P450是一類參與內(nèi)源性和外源性化合物代謝的單加氧酶，與大部分藥物及毒物的代謝有關(guān)。甲CYP2C9在人肝臟微粒體中含量豐富，約占總CYP蛋白量的20%，有多種突變等位基因，構(gòu)成了藥物代謝個體差異的基礎(chǔ)。影響CYP2C9酶催化功能的突變體主要有兩種：CYP2C9*2和CYP2C9*3。研究發(fā)現(xiàn)攜帶CYP2C9*2等位基因的個體與野生型個體華法林的臨床用藥劑量相比要降低14%～20%，攜帶CYP2C9*3等位基因的個體與野生型個體華法林的臨床用藥劑量相比要降低21%～49%。突變型可以使華法林的代謝減慢，血藥濃度增高，引起出血等不良反應(yīng)的發(fā)生。

維生素K環(huán)氧化物還原酶1（vitamin?K?epoxide?reductase?1，VKORC1）可激活維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體，主導(dǎo)維生素K依賴性凝血因子的生成，是華法林主要作用靶點。VKORC1基因位于內(nèi)含子區(qū)的1173?C>T多態(tài)性能更多顯示華法林個體劑量的差異。一項研究發(fā)現(xiàn)攜帶VKORC1(1173CC+CT)基因型的病人每天華法林的用藥劑量(?3.33±1.04?mg/d)比攜帶1173TT基因型所需要的華法林的用藥劑量(1.81?±0.63?mg/d?)高(P＜0.001)。?

目前普遍應(yīng)用的基因分型檢測方法為Taqman探針法和DNA直接測序法。Taqman熒光探針兩端分別標(biāo)記報告基團和淬滅基團，探針在未與目標(biāo)序列結(jié)合保持完整時，熒光報告基團和淬滅基團沒有分離，熒光信號被淬滅基團吸收，不能受激發(fā)出熒光；PCR擴增時，完全互補配對后由Taq酶所具有的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，熒光報告基團和淬滅基團分離，熒光檢測系統(tǒng)可以接到熒光信號，實現(xiàn)熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。如果探針與目標(biāo)序列存在錯配堿基，就會大大減少探針與目標(biāo)序列結(jié)合的緊密度及Taq酶5’端外切酶的活性，影響探針的熒光釋放量，使帶有不同堿基的DNA序列得以鑒定。這種方法步驟少，不易污染，便于對大樣本進(jìn)行分型；但對引物設(shè)計有一定的限制，對于SNP附近的序列有一定要求，受突變堿基位點與類型局限。DNA直接測序法能直接提供準(zhǔn)確的堿基信息，被當(dāng)成突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在費時費力，成本較昂貴，不適用于對大量樣本進(jìn)行檢測等缺點。

本發(fā)明應(yīng)用一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法——高分辨熔解曲線（High?resolution?melting，HRM）分析技術(shù)。通過實時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR產(chǎn)物的結(jié)合情況，SNP位點堿基不同會使雙鏈DNA的TM值發(fā)生變化從而雙鏈DNA在升溫過程中先后解開，形成不同的熔解曲線形狀，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從熒光強度與時間曲線上就可以判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點、雜合子與純合子等都會影響熔解曲線的峰形，能夠有效區(qū)分不同SNP位點與不同基因型。HRM不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，采用新型飽和染料更易于檢測單堿基突變、小片段插入或缺失。該方法與其他遺傳分型技術(shù)相比，操作簡單，具有靈敏度高、特異性好、成本低、快速、高通量檢測等優(yōu)點，結(jié)果準(zhǔn)確，且實現(xiàn)了真正的閉管操作。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種簡單易行的華法林個體化用藥相關(guān)基因多態(tài)性的檢測方法。