[發明專利]利用高分辨熔解曲線分析技術檢測華法林個體化用藥相關基因多態性的方法

無效

• 申請號: 201310431123.6
• 申請日: 2013-09-22
• 公開（公告）號: CN103525911A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 吳迪;傅詠南;張奕;王校;毛丹丹;卞雪蓮
• 申請（專利權）人: 上海中優醫藥高科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用高分辨熔解曲線分析技術檢測華法林個體化用藥相關基因多態性的方法，其特征在于，具體步驟為：

第一步：采用硅膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞/外周血細胞樣本的基因組DNA，電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，待測樣本濃度標化到10ng/ul;

第二步：采用在線軟件Primer?3設計HRM引物，確定最佳引物為18-25bp大小，PCR產物長度80-150bp，相關引物信息如下：

CYP2C9?Arg144Cys（rs1799853）引物序列：

rs1799853-F：AATTTTGGGATGGGGAAGAG

rs1799853-R：CCACCCTTGGTTTTTCTCAA

CYP2C9?A1075C（rs1057910）引物序列：

rs1057910-F：CCACATGCCCTACACAGATG

rs1057910-R：TGTCACAGGTCACTGCATGG

VKORC1?C1173T（rs9934438）引物序列：

rs9934438-F：CCGAGAAAGGTGATTTCCAA

rs9934438-R：TGACATGGAATCCTGACGTG

第三步：在每一個PCR反應孔中依次加入Type-it?HRM?PCR?Mix?7.5ul，正、反向引物溶液各0.5ul（10umol/L），檢測樣品2ul，用滅菌重蒸餾水補足15ul；在Rotor-Gene?Q上進行反應，PCR反應條件為92-97℃變性5-15分鐘，92-97℃變性10-30秒，57-65℃退火10-30秒，70-75℃延伸10-30秒，30-50個循環；HRM反應條件：92-97℃變性1分鐘，40℃復性1分鐘，初始熔解溫度60-65℃開始程序升溫熔解至95℃，過程中實時監測熒光信號，30-50次每秒;

第四步：應用Rotor-Gene?Q軟件分析HRM結果，通過標準曲線基于曲線偏移（純合子）和曲線形狀變化（雜合子）展現不同的基因型；定義已知樣本基因型后，軟件會自動調出所有檢測樣本的基因型。