[發明專利]突變檢測用探針、突變檢測方法、藥效評價方法以及突變檢測用試劑盒

有效

• 申請號: 201310430565.9
• 申請日: 2013-09-18
• 公開（公告）號: CN103667443B
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 黑瀨熏
• 申請（專利權）人: 愛科來株式會社
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 金龍河;穆德駿

本發明提供簡便地檢測ALK基因的突變、特別是ALK（L1196M）突變型和ALK（C1156Y）突變型的突變檢測用探針。本發明涉及用于檢測ALK基因的突變的突變檢測用探針，其為選自由P1～P4、P7和P8組成的組中的至少一種熒光標記寡核苷酸。

技術領域

本發明涉及突變檢測用探針、突變檢測方法、藥效評價方法以及突變檢測用試劑盒。

背景技術

作為肺癌的發病原因之一，可列舉基因突變。因此，正在推進被認為參與肺癌發病的基因的確定。作為這種被認為參與肺癌發病的基因突變，可列舉EGFR基因突變和ALK基因突變。

已知ALK(anaplastic lymphoma kinase：間變性淋巴瘤激酶)基因是編碼受體型酪氨酸激酶的基因，在2號染色體內發生倒位時，與EML4基因融合。認為由于該融合基因(EML4-ALK)，產生組成性活化酪氨酸激酶而導致肺腺癌的發病。由此，正在嘗試在肺癌治療領域使用ALK抑制劑。作為這種ALK抑制劑，已知克里唑蒂尼(crizotinib)。

但是，對于克里唑蒂尼而言，雖然在初期確認到一定的治療效果，但存在藥劑的效果不會逐漸上升至所期待的效果以上的情況。

關于這樣的抑制活性的表現，發現EML4-ALK內發生的兩個基因突變、即ALK基因的氨基酸序列中第1156位的半胱氨酸置換為酪氨酸的突變(以下有時稱為“ALK(C1156Y)”)和ALK基因的氨基酸序列中第1196位的亮氨酸置換為蛋氨酸的突變(以下有時稱為“ALK(L1196M)”)參與其中(參照非專利文獻1)。明確了顯示出如下共同的特性：這些基因突變在EML4-ALK內的克里唑蒂尼結合袋位點發生，結果使結合袋的形狀發生變化，從而使克里唑蒂尼與EML4-ALK的結合親和性下降。因此，在使用ALK抑制劑時，檢測作為用于預測其效果的預測因子的這些ALK基因突變的有無變得重要。

另一方面，近年來，作為檢測基因突變的檢測試驗，進行利用熔解曲線分析(Tm分析)的檢測。該方法中，通過PCR法擴增含有突變的區域后，使用被熒光染料標記的核酸探針進行熔解曲線分析，基于熔解曲線分析的結果來分析堿基序列的突變(例如，參照專利文獻1)。

專利文獻

專利文獻1：日本特開2002-119291號公報

非專利文獻

非專利文獻1：New England Journal of Medicine,Vol.363,pp.1734-1739(2010)

發明內容

發明所要解決的問題

非專利文獻1中，通過基于各序列直接檢測各基因突變的所謂直接測序法進行檢測，在進行DNA的提取純化和PCR后，進行測序反應，必須利用測序儀進行電泳等，耗時耗力或成本高。另外，擴增產物有可能污染其他的反應(contamination)。此外，難以自動化，不能同時檢測多個核酸序列。

專利文獻1中記載了使用被熒光染料標記的核酸探針與靶核酸雜交并測定熒光染料發光的減少量的方法。但是，在使用被熒光染料標記的核酸探針與靶核酸雜交并實施熒光染料發光的減少量測定時，并非任意序列的情況下均能實施，對于每個突變，需要找到合適的序列。

基于這樣的現狀，為了預測ALK抑制劑的效果等目的，期待開發用于檢測ALK(L1196M)突變型和ALK(C1156Y)突變型的ALK基因中的突變的有效的技術。

本發明的課題在于，提供能夠簡便地檢測ALK基因中的突變的突變檢測用探針、使用該突變檢測用探針的突變檢測方法和藥效評價方法、以及突變檢測用試劑盒。

用于解決問題的方法

本發明如下。