[發明專利]用于與EGFR基因雜交的DNA探針庫及采用其富集EGFR基因片段的方法

有效

• 申請號: 201310430173.2
• 申請日: 2013-09-18
• 公開（公告）號: CN103667270A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 邵陽
• 申請（專利權）人: 邵陽
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C40B40/06;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京瑞恒信達知識產權代理事務所(普通合伙) 11382
• 代理人: 曹津燕;張偉

技術領域

本發明涉及基因檢測領域，具體而言，本發明涉及一種EGFR基因片段的富集和提取方法，所述方法可以精準地富集EGFR基因片段，進而可以選擇性地進行EGFR基因結構突變的檢測。?

背景技術

DNA測序技術正處在天翻地覆的劇變中，其突出特點為同時對眾多的位點進行觀察分析（大規模平行），從而逐步實現測序通量的大幅增長，原始數據中每個堿基的測序成本的急劇下跌。基于此，以前高不可攀的奢侈性活動（如個人基因測序、宏基因組學研究），逐漸變得越來越切實可行。特別是隨著科學的發展，由于傳統的Sanger測序已經不能完全滿足研究的需要，下一代測序技術（第二代測序技術，Next-generation?sequencing）應運而生。?

下一代測序技術是同步化三磷酸核苷酸的洗脫方法和同步化的光學檢測方法的結合。例如采用以魯米那（Illumina）提供的儀器，以短的連續性的片段序列和測序閱讀長度的形式，每周輸出數億以計的堿基的DNA序列。這是一種由DNA連接酶和聚合酶主導化學過程的第二代測序方法，DNA序列將會用生物信息學的方法拼接還原。在成本方面，下一代測序技術比第一代測序技術大體上降低了1000倍，并且還正以指數級的速度下降。目前下一代測序技術已經廣泛應用于全基因組測序，但是在其它基因分析領域，例如特定基因結構突變的檢測等方面尚未得到充分開發。?

基因檢測是利用血液、其他體液或細胞對核酸進行檢測的技術，其通過特定設備對被檢測者核酸分子信息作檢測，分析它所含有的各種基因情況，從而使人們能了解自己的基因信息，判斷身體患有疾病的情況或風險，從而可適應性地選擇疾病治療方案，甚至預防疾病的發生。?

現有的基因突變檢測方法還主要集中于以下3個技術：?

1）PCR突變檢測?

基于PCR片段擴增和凝膠電泳分離的方法，從而分辨出野生型和突變性的差異。其缺點包括：其為單堿基突變類型檢測，不能對mRNA進行定量，不能檢測基因顛換；敏感性低；耗時長，單次只能檢測一個基因突變；不能確定堿基的具體變化；無法進行高通量檢測。?

2）Q-PCR（定量PCR）檢測?

基于熒光和PCR片段擴增來對模板mRNA多少來進行定量。其缺點包括：不能檢測單堿基類型突變；不能檢測基因顛換；只能檢測已知突變；耗時長，單次只能檢測一個基因突變；不能確定堿基的具體變化。?

3）基因芯片技術?

用高精度技術將DNA片段打印在芯片上，然后通過DNA雜交結合特性來確定突變性質。其缺點包括：不能檢測基因顛換；只能檢測已知突變；成本高，通量較小；準確率低，通常需要重復2次以上才能確定結果。?

因此可知，目前在基因檢測技術方面尚缺少更為全面、快速、簡便、準確的檢測方法，特別是在目前擁有下一代測序技術這種以高通量、低成本基因測序為特點的技術的情況下，如何基于下一代測序技術開發新型基因檢測和篩查技術，是本領域研究人員廣泛關注的問題。并且，如果應用下一代測序技術來檢測基因的結構突變情況，如何獲得能夠滿足下一代測序技術要求的基因檢測樣本，也是期待解決的一個技術問題。?

EGFR是一種可以激活細胞增殖的穿膜信號蛋白。受到上皮生長因子刺激時，會與EGFR家族的其他成員或者自身形成蛋白雙體，從而激活它自身的酪氨酸激酶活性，啟動其下游的一系列傳導因子的磷酸化。EGFR的下方通路包括MAPK和PI3K-AKT等。因此，EGFR在調節腫瘤細胞的生長、修復和生存、新生血管生成、侵襲和轉移中都具有重要的作用，同時在三分之二的人類腫瘤中都有廣泛表達。各種研究都表明，EGFR突變/表達增加在多種癌癥中扮演重要角色，如非小細胞肺癌類，前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌以及大腸癌。此外，在很多惡性腫瘤中，EGFR的表達往往與較差的預后和較低的生存率相關。?

目前已經開發了多種針對EGFR突變的單抗體，或者作為小分子抑制劑來隔斷癌癥細胞表面EGFR受體與受質的相互作用，或者抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，從而既能減緩或者抑制癌細胞生長，也能增加化療和放療的抗腫瘤功效。目前針對EGFR的腫瘤藥物主要有西妥昔單抗（Cetuximab）、?帕尼單抗（Panitumumab）、曲妥珠單抗（Trastuzumab）、以及小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑易瑞沙（Gefitinib）、特羅凱（Erlotinib）和PD168393。?

檢測EGFR基因突變，對判斷腫瘤的發生發展、治療藥物的選擇等方面均有重要意義。?

發明內容