[發(fā)明專利]用自然變異分析轉(zhuǎn)基因水稻代謝差異的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310429856.6
• 申請日: 2013-09-18
• 公開（公告）號: CN103529139A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張大兵;石建新;胡朝陽
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 上海漢聲知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 牛山;陳少凌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用自然變異分析轉(zhuǎn)基因水稻代謝差異的方法。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)基因作物是指利用基因工程技術(shù)將目的基因轉(zhuǎn)到受體基因組中形成的改良后的作物。轉(zhuǎn)基因作物可以提高作物的產(chǎn)量，改善品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值，增強(qiáng)抗蟲抗病抗旱等抗性。到目前為止全世界已經(jīng)有196個(gè)轉(zhuǎn)基因事件被商業(yè)化，包括轉(zhuǎn)基因牛羊、轉(zhuǎn)基因魚蝦、轉(zhuǎn)基因糧食、轉(zhuǎn)基因蔬菜和水果。然而公眾對轉(zhuǎn)基因作物安全性的擔(dān)憂一直沒有停止過，一方面是對食用轉(zhuǎn)基因食品的安全方面的擔(dān)憂，擔(dān)心外源性蛋白是否對人有毒性，轉(zhuǎn)基因食品中過敏蛋白含量是否會增加。另一方面是對轉(zhuǎn)基因作物對生態(tài)環(huán)境的影響，擔(dān)心抗性基因會擴(kuò)散到環(huán)境中的其他作物，特別是其野生的親緣物種中，從而產(chǎn)生超級雜草。對于消費(fèi)真來說，當(dāng)轉(zhuǎn)基因作物及其衍生物被用于食品或者飼料時(shí)，其安全性備受爭議。研究人員一直在為轉(zhuǎn)基因安全性評價(jià)作努力，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization?for?Economic?Cooperation?and?Development，OECD)在2006年首先提出了“實(shí)質(zhì)等同”原則用于評價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的安全性，該原則又被聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織(Food?and?Agriculture?Organization?of?the?United?Nations)及世界衛(wèi)生組織(World?Health?Organization)所細(xì)化。實(shí)質(zhì)等同的概念是如果一種食物或者食物成分與已經(jīng)存在的食物或者食物成分實(shí)際上是相同的，那么它就可以作為普通食物安全對待，即它可以被看成與傳統(tǒng)食物具有相同的安全性。它包擴(kuò)三個(gè)層次的內(nèi)容：化學(xué)成分等同，食用效果等同，環(huán)境影響等同。

近些年，許多研究都關(guān)注轉(zhuǎn)基因作物的組學(xué)水平的變化。這些組學(xué)方法被認(rèn)為是具有高通量、高精度和更強(qiáng)可靠性的非靶標(biāo)的方法，包括cDNA微陣列，微小RNA指紋，蛋白質(zhì)組，代謝組和毒理性輪廓。應(yīng)用代謝組學(xué)方法評價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的安全性已經(jīng)非常普遍和成功。之前的代謝組學(xué)研究基本上都是將轉(zhuǎn)基因作物的代謝組與其受體的代謝組進(jìn)行比較，這種方法忽視了品種間的自然變異，有可能導(dǎo)致對代謝組數(shù)據(jù)的誤讀，即我們不能僅僅根據(jù)轉(zhuǎn)基因作物的代謝組和其受體的代謝組有差異就認(rèn)為該轉(zhuǎn)基因作物是否安全。所以我們迫切需要將作物品種的自然變異納入到轉(zhuǎn)基因作物安全性評價(jià)體系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種將作物品種的自然變異納入到轉(zhuǎn)基因作物安全性評價(jià)體系的用自然變異分析轉(zhuǎn)基因水稻代謝差異的方法。本發(fā)明利用基于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)系統(tǒng)對生產(chǎn)上常用的水稻親本的種子進(jìn)行代謝輪廓分析，分析獲得各種代謝物在不同水稻品種中的變化范圍，并將此自然變異用于對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻種子的代謝差異進(jìn)行研究。該方法具有高靈敏度、高通量的優(yōu)點(diǎn)。由于考慮了代謝物的自然變異范圍，此方法可以為深入研究轉(zhuǎn)基因水稻的安全性提供根據(jù)。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明涉及一種用自然變異分析轉(zhuǎn)基因水稻代謝差異的方法，所述方法包括如下步驟：

A、采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對自然品種水稻種子提取物進(jìn)行分析得到水稻代謝輪廓譜，進(jìn)而獲得各種代謝物在不同自然品種水稻中的濃度變化范圍，即為代謝物在自然品種水稻中的自然變異范圍；

B、在與步驟A相同的測試條件下，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對轉(zhuǎn)基因水稻種子提取物進(jìn)行分析，分析結(jié)果與步驟A中的自然變異范圍進(jìn)行比較；代謝物濃度變化超過自然變異范圍的，說明該代謝物的變化是非預(yù)期的，代謝物濃度變化在自然變異范圍內(nèi)的，說明該轉(zhuǎn)基因水稻和自然品種在種子代謝組水平實(shí)質(zhì)上是等同的。

優(yōu)選地，所述自然品種水稻種子包括所述轉(zhuǎn)基因水稻種子的受體水稻種子；所述轉(zhuǎn)基因水稻是以非轉(zhuǎn)基因水稻為受體進(jìn)行基因插入，經(jīng)過自交并選擇具有高賴氨酸蛋白特性的轉(zhuǎn)基因水稻。

優(yōu)選地，所述自然品種水稻種子為中國水稻數(shù)據(jù)庫中包含的核心骨干品種。

優(yōu)選地，所述對水稻種子提取物進(jìn)行分析具體包括如下步驟：

a、取水稻種子樣品，分別在液氮中研磨成粉末；

b、所述樣品粉末中加入超純水，震蕩懸浮，懸浮液中加入提取液用以沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，離心后，每種樣品取三份上清液，氮?dú)庀麓蹈珊罄鋬龀楦桑纬扇荽郎y樣品，分別進(jìn)行LC(+)，LC(-)，和GC-MS分析；