[發明專利]用自然變異分析轉基因水稻代謝差異的方法

有效

• 申請號: 201310429856.6
• 申請日: 2013-09-18
• 公開（公告）號: CN103529139A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 張大兵;石建新;胡朝陽
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 牛山;陳少凌

1.一種用自然變異分析轉基因水稻代謝差異的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

A、采用超高效液相色譜-質譜聯用和氣相色譜-質譜聯用技術對自然品種水稻種子提取物進行分析得到水稻代謝輪廓譜，進而獲得各種代謝物在不同自然品種水稻中的濃度變化范圍，即為代謝物在自然品種水稻中的自然變異范圍；

B、在與步驟A相同的測試條件下，采用超高效液相色譜-質譜聯用和氣相色譜-質譜聯用技術對轉基因水稻種子提取物進行分析，分析結果與步驟A中的自然變異范圍進行比較；代謝物濃度變化超過自然變異范圍的，說明該代謝物的變化是非預期的，代謝物濃度變化在自然變異范圍內的，說明該轉基因水稻和自然品種在種子代謝組水平實質上是等同的。

2.根據權利要求1所述的用自然變異分析轉基因水稻代謝差異的方法，其特征在于，所述自然品種水稻種子包括所述轉基因水稻種子的受體水稻種子；所述轉基因水稻是以非轉基因水稻為受體進行基因插入，經過自交并選擇具有高賴氨酸蛋白特性的轉基因水稻。

3.根據權利要求2所述的用自然變異分析轉基因水稻代謝差異的方法，其特征在于，所述自然品種水稻種子為中國水稻數據庫中包含的核心骨干品種。

4.根據權利要求1、2或3所述的用自然變異分析轉基因水稻代謝差異的方法，其特征在于，所述對水稻種子提取物進行分析具體包括如下步驟：

a、取水稻種子樣品，分別在液氮中研磨成粉末；

b、所述樣品粉末中加入超純水，震蕩懸浮，懸浮液中加入提取液用以沉淀樣品中的蛋白質，離心后，每種樣品取三份上清液，氮氣下吹干后冷凍抽干，形成三份待測樣品，分別進行LC(+)，LC(-)，和GC-MS分析；

c、將步驟b中LC(+)，LC(-)，和GC-MS分析獲得的每個品種每種代謝物的濃度轉化為標準分數z-score；將水稻種子代謝物濃度C取對數，對應的z-score=(Log2C-mean)／SD，其中，mean為所有自然品種中每種代謝物濃度均值，SD為自然品種中每種代謝物的標準偏差。

5.根據權利要求4所述的用自然變異分析轉基因水稻代謝差異的方法，其特征在于，所述對水稻種子提取物進行分析還包括：采用參照檢測組分別進行LC(+)，LC(-)，和GC-MS分析，用于檢測分析系統的穩定性；所述參照檢測組選自所述步驟b中的三種待測樣品混合形成的待測混合物、人的血漿樣品、水中的一種或幾種。

6.根據權利要求4所述的用自然變異分析轉基因水稻代謝差異的方法，其特征在于，所述步驟b中待測樣品用于LC(+)分析時具體為：在待測樣品中加入含有LC(+)稀釋液后，采用超高效液相色譜-質譜聯用法測定代謝物，并使用UHPLC-MS(+)模式進行分析。

7.根據權利要求4所述的用自然變異分析轉基因水稻代謝差異的方法，其特征在于，所述步驟b中待測樣品用于LC(-)分析時具體為：在待測樣品中加入LC(-)稀釋液后，采用超高效液相色譜-質譜聯用法測定代謝物，并使用UHPLC-MS(-)模式進行分析。

8.根據權利要求4所述的用自然變異分析轉基因水稻代謝差異的方法，其特征在于，所述步驟b中待測樣品用于GC-MS分析時具體為：在待測樣品中加入稀釋溶劑和衍生化試劑進行衍生化反應，離心后放入GC／MS上樣室進行檢測。

9.根據權利要求4所述的用自然變異分析轉基因水稻代謝差異的方法，其特征在于，所述對水稻種子提取物進行分析還包括：用R軟件將步驟c得到的z-score值轉化成z-plot圖。