[發明專利]一種基因工程菌及其生產谷氨酰胺轉胺酶酶原的方法

無效

• 申請號: 201310428446.X
• 申請日: 2013-09-18
• 公開（公告）號: CN103497904A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;王淼;劉松;萬丹
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/10;C12N15/54;C12N15/81;C12R1/645
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種基因工程菌及其生產谷氨酰胺轉胺酶酶原的方法，屬于酶工程技術領域。

技術背景

微生物谷氨酞胺轉胺酶(TransglutaminaseEC2.3.2.13全稱R-glutaminyl-peptide:amine-γ-glutayle-transferase簡稱TGase)，能夠催化蛋白質肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基與各種酰基受體發生酰胺基轉移反應，形成ε-(γ-谷氨酰基)賴氨酸共價鍵，引起蛋白質分子內、分子間發生交聯、蛋白質和氨基酸之間的連接以及蛋白質分子內谷氨酞胺基的水解。目前，鏈霉菌TGase已廣泛用于食品工業，適量添加TGase可顯著改善各類食品蛋白質的功能性質和營養價值，應用范圍包括肉制品、水產品、乳制品、植物蛋白制品等。此外，TGase在一些非食品工業領域也具有較大的應用前景，如組織工程、紡織工業及生物學研究等。然而，依靠優勢菌種選育和過程優化的傳統發酵技術對TGase產量的提高已十分有限，遠不能滿足市場需求。

在前期研究中，本研究室篩選出一株產谷氨酰胺轉胺酶(簡稱TGase)的吸水鏈霉菌（Streptomyces?hygroscopicus?CCTCC?M203062），通過基因克隆方法，得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的啟動子和終止子（Genebank：EU477523），并實現了MTG和其酶原區在大腸桿菌中的高效表達（Liu?S,Zhang?D,Wang?M,Cui?W,Chen?K,Liu?Y,Du?G,Chen?J,Zhou?Z(2011)The?pro-region?of?Streptomyces?hygroscopicus?transglutaminase?affects?its?secretion?by?Escherichia?coli.FEMS?Microbiol?Lett324(2):98-105）。

解脂耶氏酵母于1942年首次被分離得到,先后被命名為Candida?lipolytica、Endomycopsis?lipolytica、Saccharomycopsis?lipolytica,最終定名為Yarrowia?lipolytica(解脂耶氏酵母)。解脂耶氏酵母是研究的最廣泛的非常規酵母之一,曾相繼用于工業化規模生產單細胞蛋白、檸檬酸。由于它具有很強的分泌蛋白的能力,因此是一種很有潛力的表達異源蛋白的宿主生物。由于強有力的基因擴增系統的發展，逆轉錄轉座子的發現,調控型和組成型的強啟動子的鑒定,近年來解脂耶氏酵母作為異源蛋白表達宿主的研究進展很快，迄今已有42個異源蛋白在解脂耶氏酵母中得到了表達，而且大多數蛋白的表達都能達到毫克/升。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種高效表達谷氨酰胺轉胺酶酶原的基因工程菌，是用來自吸水鏈霉菌（Streptomyces?hygroscopicus）CCTCC?M203062的谷氨酰胺轉胺酶酶原(proTG)，構建重組表達載體pINA1297-proTG，并將其轉化解脂耶氏酵母Yarrowia?lipolytica?WSH-Z06，得到基因工程菌pINA1297-proTG/Y.lipolytica?WSH-Z06。

本發明所使用菌種為解脂耶氏酵母Yarrowia?lipolytica?WSH-Z06，來源于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC?NO：M207143。

本發明還提供了一種利用上述重組菌發酵生產谷氨酰胺轉胺酶酶原的方法，步驟如下：

1）擴增得到谷氨酰胺轉胺酶酶原（proTG）的PCR產物；

2）將回收的proTG的PCR產物片段和質粒pINA1297分別進行SfiI單酶切，然后加入KpnI酶切，酶切片段進行柱回收，酶切質粒pINA1297進行膠回收，將二者連接過夜，轉化大腸桿菌感受態細胞，使用卡那霉素抗性平板篩選陽性轉化子；

3）將經驗證構建成功的重組質粒pINA1297-proTG用NotI線性化，膠回收片段轉化至解脂耶氏酵母；

4）利用重組菌發酵生產谷氨酰胺轉胺酶酶原。

proTG可擴增自本實驗室前期構建載體pET22b(+)/proTG（已發表文章）或根據Genebank：EU477523相關信息人工合成。

具體而言，重組菌株構建方法如下：

(1)proTG引物設計

根據pET22b(+)/proTG基因序列設計proTG基因的PCR引物P1和P2。