[發(fā)明專利]一種基因工程菌及其生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310428446.X
• 申請日: 2013-09-18
• 公開（公告）號(hào): CN103497904A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳堅(jiān);堵國成;王淼;劉松;萬丹
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N9/10;C12N15/54;C12N15/81;C12R1/645
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種高效表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的基因工程菌，其特征在于，用來自吸水鏈霉菌CCTCC?M203062的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原，構(gòu)建重組表達(dá)載體pINA1297-proTG，并將其轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母，得到基因工程菌pINA1297-proTG/Y.lipolytica?WSH-Z06。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原擴(kuò)增自載體pET22b(+)/proTG或根據(jù)Genebank：EU477523合成。

3.一種發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的方法，其特征在于，用來自吸水鏈霉菌CCTCC?M203062的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原，構(gòu)建重組表達(dá)載體pINA1297-proTG，并將其轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母得到重組菌，利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟如下：

1）將谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原基因和質(zhì)粒pINA1297分別進(jìn)行SfiI單酶切，然后加入KpnI酶切，酶切片段進(jìn)行柱回收，酶切質(zhì)粒pINA1297進(jìn)行膠回收，將二者連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，使用卡那霉素抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子；

2）將經(jīng)驗(yàn)證構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pINA1297-proTG用NotI線性化，膠回收片段轉(zhuǎn)化至解脂耶氏酵母得到重組菌；

3）利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟如下：

1）擴(kuò)增得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的PCR產(chǎn)物；

2）將回收的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的PCR產(chǎn)物片段和質(zhì)粒pINA1297分別進(jìn)行SfiI單酶切，然后加入KpnI酶切，酶切片段進(jìn)行柱回收，酶切質(zhì)粒pINA1297進(jìn)行膠回收，將二者連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，使用卡那霉素抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子；

3）將經(jīng)驗(yàn)證構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pINA1297-proTG用NotI線性化，膠回收片段轉(zhuǎn)化至解脂耶氏酵母得到重組菌；

4）利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原擴(kuò)增自載體pET22b(+)/proTG。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原擴(kuò)增引物為：

P1：5’-TTGGGCCGTTCTGGCC?GCCAGCGGCGGCGACG-3’

P2:5’-CGCGGATCC?TTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3’。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，具體步驟如下：

1)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原引物設(shè)計(jì)

根據(jù)pET22b(+)/proTG基因序列設(shè)計(jì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原基因的PCR引物P1和P2

P1：5’-TTGGGCCGTTCTGGCC?GCCAGCGGCGGCGACG-3’

P2:5’-CGCGGATCC?TTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3’；

2)重組表達(dá)載體pINA1297-proTG的構(gòu)建

利用引物P1，P2，以pET22b(+)/proTG質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的PCR產(chǎn)物，按照膠回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物，將回收到的片段和質(zhì)粒pINA1297分別進(jìn)行SfiI單酶切，50℃，1h，然后加入KpnI酶切，37℃，45min后，酶切片段進(jìn)行柱回收，酶切質(zhì)粒pINA1297進(jìn)行膠回收，將二者按一定比例連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coli?JM109感受態(tài)細(xì)胞，使用卡那霉素抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)SfiI單酶切，50℃，1h,再經(jīng)KpnI酶切，37℃，45min，釋放出大小為5.2kb和1.1kb的基因片段，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒命名為p?INA1297-proTG；

3)重組質(zhì)粒p?INA1297-proTG轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母

將經(jīng)驗(yàn)證構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒p?INA1297-proTG用NotI線性化，膠回收片段轉(zhuǎn)化至解脂耶氏酵母中；

4)轉(zhuǎn)化子基因組插入片段檢測

挑取YNB平板上解脂耶氏酵母單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，提取菌株的基因組DNA，具體操作步驟按照天根提酵母基因組試劑盒說明書進(jìn)行，以P1，P2為引物，基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證；

5）利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原。