[發明專利]檢測彌散粘附性大腸埃希氏菌的引物、探針及方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201310424938.1
• 申請日: 2013-09-17
• 公開（公告）號: CN103451305A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 王雷;莫莎;王曉艷;張志強
• 申請（專利權）人: 北京卓誠惠生生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 穆宏平

技術領域

本發明屬微生物檢測領域，涉及檢測彌散粘附性大腸埃希氏菌的引物、探針及方法和試劑盒

背景技術

大腸埃希氏菌是人類腸道中正常菌群的一部分，但某些血清型的菌株能引起尿道感染、菌血癥、腦膜炎和腹瀉等臨床癥狀，這些通常是由五種致瀉性大腸埃希氏菌引起，包括產志賀毒素大腸埃希氏菌（STEC）、腸產毒性大腸埃希氏菌（ETEC）、腸致病性大腸埃希氏菌（EPEC）、腸侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）和腸集聚性大腸埃希氏菌（EAEC）。其中，EPEC和EAEC均為黏附性大腸埃希氏菌（AEC），EPEC是定位粘附（LA）模式，EAEC是集聚性粘附（AA）模式。最新研究發現一種新的粘附性大腸埃希氏菌，在體外表現出對HEp-2細胞彌散性粘附的特征，這與以前兩種AEC有著顯著的差別，稱之為“彌散粘附性大腸埃希氏菌（DAEC）”。

研究表明，DAEC主要感染1-5歲兒童，引起水樣腹瀉，但不引起嬰兒腹瀉，這與其他致瀉性大腸埃希氏菌也有顯著的不同。通過血清學分析，發現DAEC主要集中在O:86，O:127，O:142，O:158四個血清型，這與EPEC經常出現的血清型有部分交叉(Diffusely?adherent?Escherichia?coli?strains?isolated?from?children?and?adults?constitute?two?different?populations,BMC?Microbiology2013,13:22)。

DAEC檢測最經典和準確的方法是體外培養，觀察待檢DAEC菌株對HEp-2細胞的致病變特征來判定其致病性，一般典型的特征是出現彌散性粘附（DA），不同于定位粘附和聚集性粘附。此方法雖然準確，但是操作繁瑣，不適合開展大規模樣品的篩查，也不能滿足應急檢測的需求。血清學鑒定和分類只能提供傳統意義上基于O抗原對大腸埃希氏菌的分型，無法解決致瀉型的區分。

隨后發展起來的DNA探針技術，從分子水平上探討DAEC的毒力因子，篩選出afa基因家族和AIDI-I可能是導致DAEC彌散性粘附的特征性毒力因子，主要使用daaC探針和AIDI-I探針(Molecular?Characterization?of?a?Fimbrial?Adhesin,F1845,Mediating?Diffuse?Adherence?of?Diarrhea-Associated?Escherichia?coli?to?HEp-2Cells,JOURNAL?OF?BACTERIOLOGY,Aug.1989,p.4281-4289;Cloning?and?Expression?of?an?Adhesin(AIDA-I)Involved?in?Diffuse?Adherence?of?Enteropathogenic?Escherichia?coli，INFECTION?AND?IMMUNITY,May1989,p.1506-1511)，其中daaC探針是afa基因家族的重要成員，在彌散性粘附因子表達方面起到重要的作用，daaC探針檢測與HEp-2細胞病變鑒定的一致率超過75%；而AIDI-I探針作為分子檢測標志，研究表明與HEp-2細胞病變鑒定的一致率僅有2%。此方法涉及到基因組提取技術、基因重組技術、克隆構建與篩選技術、分子雜交技術等，步驟相當繁瑣和復雜，也不適用于大規模樣品的篩查。

普通PCR技術出現后，普通PCR檢測DAEC的方法在操作步驟和操作時間上都大為縮短，檢測靈敏度也有所提高，適合進行中大量樣品的快速篩查，但是普通PCR技術需要打開PCR管進行產物分析，這增加了PCR產物污染的可能性，容易出現假陽性結果，另外，普通PCR技術的靈敏度還不夠高，對DAEC菌量低的樣品可能無法檢測，造成假陰性結果。