[發(fā)明專利]小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌毒力基因多重PCR檢測引物組和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310424328.1
• 申請日: 2013-09-17
• 公開（公告）號: CN103468811A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王雷;王曉艷;王彥威;張志強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 北京卓誠惠生生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 穆宏平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬微生物檢測領(lǐng)域，涉及小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌毒力基因多重PCR檢測引物組和試劑盒。

背景技術(shù)

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是一種新發(fā)腸道傳染病，自20世紀(jì)80年代逐漸引起全球的廣泛重視，是歐美等國家感染性腹瀉的主要病原體之一。該細(xì)菌普遍存在于自然環(huán)境中，水、土壤和食物中均有發(fā)現(xiàn)，在家畜、家禽中廣泛攜帶。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是一種重要的食源性致病菌，它可以在低溫條件下生長，通過污染食品可以導(dǎo)致以腸道癥狀為主的食物中毒，嚴(yán)重時病患可產(chǎn)生呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼結(jié)綈組織等疾患，甚至引起敗血癥，造成死亡。

對小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的鑒定，通常采用種內(nèi)保守種間差異大的基因作為檢測目標(biāo)。16S?rRNA具有高度的保守性和特異性，是理想的鑒別小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的目標(biāo)序列。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌存在多種血清型，但并不是每個血清型都能引起人類致病，而且是否引起人類致病是由菌株所攜帶的毒力基因決定的。不同國家和地區(qū)主要致病血清型存在差異，比如美國O:8型占優(yōu)勢，其次是O:5,27；日本以O(shè):3型為主，其次是O:6血清型；比利時以O(shè):3型為主，其次是O:9型。在中國，存在多達(dá)58個血清型，但引起人類致病的以O(shè):3型和O:9型為主，O:8血清型在國外具有很強(qiáng)的毒力，而國內(nèi)的O:8血清型分離株均缺乏毒力因子。

已證實小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的致病因子是染色體DNA上的粘附侵襲位點基因（ail）、耐熱腸毒素A基因(ystA)、質(zhì)粒上的粘附素基因（yadA）和毒力活化因子基因（virF）的表達(dá)與調(diào)控的結(jié)果。另外生物1A型還攜帶與ystA同族的腸毒素基因——ystB，其作用目前尚不清楚。

目前經(jīng)典的細(xì)菌學(xué)檢查方法是細(xì)菌分離培養(yǎng)和生化鑒定，一般在25℃培養(yǎng)24小時，采用特定性質(zhì)的培養(yǎng)基，比如按照國際標(biāo)準(zhǔn)ISO10273:2003使用PSB和ITC培養(yǎng)基分離；然后采用賴氨酸脫羥酶試驗、蔗糖試驗、海藻糖試驗、木糖試驗、脂肪酶試驗和檸檬酸鹽試驗等分析和確證小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。通過傳統(tǒng)方法分析可以獲得小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌種屬鑒定特征，但無法獲得其致病性的數(shù)據(jù)和信息。

在生化鑒定的基礎(chǔ)上，應(yīng)用血清凝集原理可以鑒定出菌株不同的血清型別，但是不同血清型別與菌株致病性沒有必然聯(lián)系，比如中國的O:8血清型通常不對人致病，但美國的O:8血清型具有很強(qiáng)的毒力，原因是中國的O:8血清型缺乏毒力因子。因此，血清型別鑒定方法無法獲得毒力因子分析數(shù)據(jù)。

當(dāng)前分子生物學(xué)檢測方法為毒力基因的檢測提供了良好的檢測工具，如中國專利申請?zhí)枮?01110275661.1的發(fā)明專利公開了一種基于實時熒光定量PCR技術(shù)的檢測試劑盒，試劑盒由前引物、后引物、TaqMan探針、熒光PCR預(yù)混液、ROX液、純水和陽性標(biāo)準(zhǔn)液等成分組成，使用實時熒光PCR儀，由前后引物和TaqMan探針與ail基因特異性結(jié)合、擴(kuò)增，從而實現(xiàn)對致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測與分析。再如中國專利申請?zhí)枮?01210448992.5的發(fā)明專利公開了一種基于核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)的檢測試劑盒；再如文獻(xiàn)“Real-Time?PCR?Method?for?Detection?of?Pathogenic?Yersinia?enterocolitica?in?Food”（APPLIED?AND?ENVIRONMENTAL?MICROBIOLOGY,Oct.2008,p.6060–6067）公開了一種基于實時熒光定量PCR技術(shù)的檢測方法，該方法采用針對ail基因的引物探針序列，擴(kuò)增出特異性的基因片段——163bp的擴(kuò)增子，以分析和檢測致病性的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌株；再如文獻(xiàn)“O:3和O:9小腸結(jié)腸炎耶爾森菌主要毒力基因分布調(diào)查”（中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2004年8月第15卷第4期）提供了一種分析O:3和O:9血清型菌株毒力基因的檢測方法，該方法設(shè)計了一整套針對ail基因、ystA基因、ystB基因、yadA基因、virF基因的引物對，使用普通單重PCR反應(yīng)體系，包括DNA聚合酶、PCR緩沖液、特異性引物對，MgCl₂，dNTP等成分，對小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的常見毒力基因進(jìn)行逐一檢測。

普通單重PCR方法、實時熒光PCR方法和等溫擴(kuò)增PCR方法可以對小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌種屬鑒定基因、毒力基因和血清型基因逐個進(jìn)行檢測。7對引物的退火溫度和濃度不盡相同，需要7輪PCR反應(yīng)逐一檢測，這種方法操作繁瑣，耗費時間和人力，需要分別做好每個反應(yīng)體系的質(zhì)量控制，比如內(nèi)部質(zhì)控。目前尚未有采用多重PCR對與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌致病相關(guān)的毒力基因進(jìn)行全面檢測的報道。