[發明專利]小腸結腸炎耶爾森氏菌毒力基因多重PCR檢測引物組和試劑盒

有效

• 申請號: 201310424328.1
• 申請日: 2013-09-17
• 公開（公告）號: CN103468811A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 王雷;王曉艷;王彥威;張志強
• 申請（專利權）人: 北京卓誠惠生生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 穆宏平

1.一種小腸結腸炎耶爾森氏菌毒力基因多重PCR檢測引物組，其特征在于，其是由檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌16S?rRNA及其毒力基因和血清型的引物對組成；

其中，檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌毒力基因和血清型的引物對是由檢測粘附侵襲位點基因、耐熱腸毒素A基因、粘附素基因、耐熱腸毒素B基因、毒力活化因子基因、O:3血清型抗原編碼基因的6個引物對組成；

所述檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌16S?rRNA基因引物對的上下游引物的核苷酸序列分別由SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2所示；

所述檢測粘附侵襲位點基因引物對的上下游引物的核苷酸序列分別由SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4所示；

所述檢測耐熱腸毒素A基因引物對的上下游引物的核苷酸序列分別由SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.6所示；

所述檢測粘附素基因引物對的上下游引物的核苷酸序列分別由SEQ?ID?NO.7、SEQ?ID?NO.8所示；

所述檢測耐熱腸毒素B基因引物對的上下游引物的核苷酸序列分別由SEQ?ID?NO.9、SEQ?ID?NO.10所示；

所述檢測毒力活化因子基因引物對的上下游引物的核苷酸序列分別由SEQ?ID?NO.11、SEQ?ID?NO.12所示；

所述檢測O:3血清型抗原編碼基因引物對的上下游引物的核苷酸序列分別由SEQ?ID?NO.13、SEQ?ID?NO.14所示。

2.一種小腸結腸炎耶爾森氏菌毒力基因多重PCR檢測的方法，其特征在于，將權利要求1所述引物組與待測增菌液或平板分離菌落提取DNA進行多重PCR反應，反應結束后對PCR反應產物進行電泳分析以確定樣品中是否含有小腸結腸炎耶爾森氏菌和含有的毒力基因種類和血清型。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，在進行多重PCR反應時，反應體系中還加入陽性內對照引物對，與檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌16S?rRNA及其毒力基因和血清型的引物對組成引物混合物。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述陽性內對照引物對的上下游引物的核苷酸序列分別由SEQ?ID?NO.15和SEQ?ID?NO.16所示。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述多重PCR反應體系為：Taq?DNA聚合酶1-2U，5×PCR?buffer（Tris·HCl100mM（PH8.3），KCl250mM，tween-200.2%）5μL，10mm的dNTP0.5-1.5μL，25mM的MgCl₂1-5μL，10×引物混合物2.5μL，陽性內對照模板pET28a0.0003-0.01ng，DNA模板2-5μL，超純水補至25μL。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，引物混合物中各引物對的引物終濃度為1-8μM。

7.根據權利要求2-6任一項所述的方法，其特征在于，所述多重PCR反應按以下步驟進行：

a：95℃4min；

b：95℃15-60s，

c：55-65℃15-60s，

d：72℃30-120s，b-d循環30-35個反應；

e：72℃5-10min。

8.一種含有權利要求1所述的多重PCR檢測引物組的試劑盒。