[發明專利]檢測PRRSV的多重熒光定量RT-PCR方法及其應用

有效

• 申請號: 201310424225.5
• 申請日: 2013-09-17
• 公開（公告）號: CN103725793A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 施開創;莫勝蘭;胡杰;鄒聯斌;張步嫻;屈素潔;陸文俊;粟艷瓊;蘇凱;李軍
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 朱萍球

技術領域

本發明屬于動物病毒分子生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的多重熒光定量RT-PCR方法，及其應用于同時對PRRSV美洲型經典毒株、美洲型變異毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株進行快速檢測。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome,?PRRS），又稱“豬藍耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus,?PRRSV）引起豬的一種高度接觸性傳染病，臨床上主要表現為妊娠母豬流產、早產、產死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各種年齡豬特別是仔豬的嚴重呼吸道疾病。PRRS最早于1987年在美國發生，1991年荷蘭首次分離到PRRSV，美國亦于1992年分離到該病毒。此后，該病相繼在各主要養豬國家發生，現已呈世界性流行，給世界各國養豬業造成巨大的經濟損失。根據病毒基因組的差異，PRRSV可分為歐洲型和美洲型毒株，兩種基因型毒株之間基因組差異很大，核苷酸序列同源性僅為60?%左右。1996年郭寶清等首次在國內分離到PRRSV，證實該病在我國存在。2006年國內爆發高致病性豬藍耳病（HP-PRRS），并證實其病原是以Nsp2蛋白481?aa和533~561?aa發生30個氨基酸不連續缺失為標志的高致病性變異毒株（HP-PRRSV）。2010年我國開始在臨床使用HP-PRRSV致弱的活疫苗，以便有效防控HP-PRRS。這些弱毒疫苗毒株包括由JXA1株致弱的JXA1-R株、由HuN4株致弱的HuN4-R株、由TJ株致弱的TJM-F92株等。其中，TJM–F92疫苗株是在HP-PRRS發病豬體內分離的高致病性強毒TJ?株通過噬斑篩選后，在Marc-145細胞上傳代至92?代，獲得了致弱的疫苗毒TJM–F92株。TJM–F92株Nsp2蛋白除了與其它HP-PRRSV一樣在多變區不連續缺失30?aa以外，還出現了第1882~2441?aa共120個氨基酸(360個堿基)的連續缺失。2010年農業部批準臨床使用HP-PRRSV致弱的活疫苗以來，廣西一直采購、使用TJM–F92株活疫苗，而未采購、使用其他弱毒株活疫苗，以便于正確區分臨床發病豬體內的PRRSV野毒株和疫苗株。

當前，國內PRRSV美洲型流行毒株既有經典毒株，也有HP-PRRSV，加上臨床使用的弱毒疫苗株，在臨床檢測中經常發現在同一地區甚至同一養殖場的豬群中同時存在兩種或兩種以上的病毒株，給該病的診斷帶來極大的困難，這就使得建立PRRSV的快速鑒別檢測方法顯得尤為重要。迄今，國內外建立了一些技術，包括雙抗體夾心ELISA、間接免疫熒光抗體試驗（IFA）、原位雜交技術（ISH）、反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、單重及多重熒光定量RT-PCR等。但是已經建立的技術都無法同時檢測并區分PRRSV美洲型經典毒株、變異毒株以及TJM-F92疫苗毒株。因此，建立能同時檢測并區分PRRSV美洲型經典毒株、變異毒株以及TJM-F92疫苗株的檢測方法不僅能彌補現有技術在這一領域的空白，還具有創新性實踐意義。

熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied?Biosystems公司推出，是指在PCR體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR過程，最后通過標準曲線對待測模板進行定性、定量分析的方法。由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已被廣泛應用于細菌、病毒等病原體檢測、腫瘤基因檢測、免疫分析、基因表達、基因突變及其多態性的研究等多個領域。多重熒光定量PCR是熒光定量PCR的一種特殊形式，是在同一反應體系中加入多對引物和多條探針，同時擴增、檢測多個模板的熒光定量PCR技術。

發明內容

本發明的目的是采用多重TaqMan熒光定量RT-PCR技術，針對PRRSV美洲型經典毒株、變異毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株基因組中的保守序列，建立同時檢測PRRSV的多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法，提供同時檢測并區分PRRSV美洲型經典毒株、變異毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株的引物、探針及其方法。本發明特異性強、靈敏度高，操作安全方便，能實現PRRSV美洲型經典毒株、變異毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株等三種毒株的同時檢測，為PRRSV美洲型野毒株、弱毒疫苗株的同時快速鑒別檢測及有效防控HP-PRRS提供了新的途徑，具有良好的應用前景。