[發明專利]檢測PRRSV的多重熒光定量RT-PCR方法及其應用

有效

• 申請號: 201310424225.5
• 申請日: 2013-09-17
• 公開（公告）號: CN103725793A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 施開創;莫勝蘭;胡杰;鄒聯斌;張步嫻;屈素潔;陸文俊;粟艷瓊;蘇凱;李軍
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 朱萍球

1.一種檢測PRRSV的多重熒光定量RT-PCR方法,?該方法利用AM-PRRSV引物對、TJM-PRRSV引物對、AM-V-PRRSV-P探針、AM-C-PRRSV-P探針、TJM-PRRSV-P探針對陽性對照樣品、檢測樣品進行熒光定量RT-PCR擴增，擴增后收集熒光信號，其特征在于，所述的TJM-PRRSV引物對其上游引物核苷酸序列為5'-?CAACCCTGCACCTGTGTCAT?-3'，下游引物核苷酸序列為5'-?TTCTCCCTTGGAGGGTGCC?-3'；所述的TJM-PRRSV-P探針為5'-F-?AGCTCCCTGGGTTCAGTGGCC?-Q-3'，其中F為報告熒光基團，Q為淬滅熒光基團。

2.根據權利要求1所述的檢測PRRSV的多重熒光定量RT-PCR方法,其特征在于，所述的AM-PRRSV引物對的上游引物核苷酸序列為5'-?GAGTGGGTCGGCTCCAGTTC?-3'，下游引物核苷酸序列為5'-?GCCTCATATTCCGTCTGTGA?-3'；

所述的AM-V-PRRSV-P探針為5'-F-?TAGAACTGTGACAACAACGCTGA?-Q-3'；?

所述的AM-C-PRRSV-P探針為5'-F-?AACTGTGTCTCGACCGGTGAC?-Q-3'；

其中F為報告熒光基團，Q為淬滅熒光基團。

3.根據權利要求1~2任一項所述的檢測PRRSV的多重熒光定量RT-PCR方法,其特征在于，所述的F為FAM、TAMRA、JOE中的任一種；所述的Q為BHQ或MGB。

4.根據權利要求3所述檢測PRRSV的多重熒光定量RT-PCR方法,?其特征在于，所述RT-PCR擴增反應體系還包括Premix?Ex?Taq^TM試劑、ROX?參比染料、模板、滅菌雙蒸水。

5.根據權利要求4所述檢測PRRSV的多重熒光定量RT-PCR方法,?其特征在于，當RT-PCR擴增體系為陽性對照樣品反應時，所述的模板為p-C-Nsp2質粒、p-V-Nsp2質粒和p-TJM-F92質粒標準品混合液；當RT-PCR擴增體系為檢測樣品反應時，所述的模板為從疑似PRRSV感染的動物組織或血清抽提的總RNA反轉錄獲得的cDNA。

6.根據權利要求4~5任一項所述的檢測PRRSV的多重熒光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述p-C-Nsp2質粒為含有美洲型經典毒株VR-2332株Nsp2基因的陽性標準質粒；所述p-V-Nsp2質粒為含有美洲型變異毒株JXA1株Nsp2基因的陽性標準質粒；所述p-TJM-F92質粒為含有高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株Nsp2基因的陽性標準質粒。

7.根據權利要求6所述檢測PRRSV的多重熒光定量RT-PCR方法,?其特征在于，所述的RT-PCR擴增反應條件為95℃?2min→95℃?10s→54℃?30s，進行40個循環，同時收集熒光信號。

8.根據權利要求7所述檢測PRRSV的多重熒光定量RT-PCR方法,?其特征在于，所述的RT-PCR擴增反應體系包括：Premix?Ex?Taq^TM10~12.5ul,?25pmol/μL?AM-PRRSV上游引物0.2~0.4ul，25pmol/μL?AM-PRRSV下游引物0.2~0.4?ul，25pmol/μL?AM-V-PRRSV-P探針0.15~0.25ul，25pmol/μL?AM-C-PRRSV-P探針0.2~0.4ul，25pmol/μL?TJM-PRRSV上游引物0.8~1.2ul，25pmol/μL?TJM-PRRSV下游引物0.8~1.2ul，25pmol/μL?TJM-PRRSV-P探針0.5~0.7ul，ROX?參比染料0.4~0.5ul，模板1.0~2.0ul，雙蒸水2.0~8.25ul。