[發明專利]一種枳椇懸浮細胞生產黃酮的方法

在審

• 申請號: 201310423711.5
• 申請日: 2013-09-17
• 公開（公告）號: CN103468632A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 楊存
• 申請（專利權）人: 南京通澤農業科技有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C07D311/40
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及組培條件下枳椇懸浮細胞的培養，尤其是鈣離子對懸浮細胞中黃酮的調控。

背景技術

枳椇（Hovenia?acerba?Lindl.），又名拐棗、雞爪梨、木室、龍棗、長壽果，為鼠李科（Rhamnaceae）枳椇屬（Hovenia?Thunb）植物。它集材、果、藥、觀賞于一身，生長快，適應性強，是一種極具開發價值的珍稀樹種。主要分布在陜西、四川、重慶、湖北、湖南、江西、江蘇、浙江、福建、廣東、安徽、河北、河南等省。到目前為止共從該屬植物中分離出?70?多種成分，主要為黃酮類和三萜皂苷類化合物。枳椇全身都是寶。枳椇具有解酒、保肝、抗癌、抗衰老等作用，我國枳椇資源豐富，但優良品種較少，目前的主要繁殖方法單一，多為實生繁殖。用枳椇成熟植株不同外植體進行組培并成功分化成完整植株的工作，國內外尚未見報道。未來既要利用傳統的雜交、誘變方式，也要利用分子生物學的方式培育出更適應人們需求的新品種。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供枳椇懸浮細胞培養的快速繁殖方法，并通過水楊酸對懸浮細胞調控獲得生長良好，黃酮含量高的懸浮細胞。

為解決上述技術問題，本發明采用下列技術方案：選用枳椇幼嫩的葉片，用洗潔精浸泡三分鐘，自來水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用0.1％的升汞消毒9分鐘，無菌水沖洗4-5次。接種在MS+NAA0.2?mg/L+IBA3mg/L愈傷組織誘導培養基上，培養條件為暗室培養，溫度25℃，濕度50%～60%，將誘導出來的愈傷組織接入液體培養基MS+NAA0.2mg/L+?2，4-D0.3mg/L上進行懸浮細胞培養30天，轉速：90r/min，溫度25℃，待懸浮細胞生長穩定，在培養基中附加前體物誘導子檸檬酸進行枳椇懸浮細胞的調控，取培養出來的枳椇懸浮細胞使用微波提取方法提取黃酮，采用HPLC法檢測黃酮的含量。

采用本發明制備的枳椇懸浮細胞，生長速度快，能耗小，污染小，黃酮含量3.713%。

下面將結合具體實施方式對本發明作進一步闡述，但本發明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。

具體實施方式

實施例1

選用枳椇幼嫩的葉片，用洗潔精浸泡三分鐘，自來水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用0.1％的升汞消毒9分鐘，無菌水沖洗?4-5?次。接種在MS+NAA0.1mg/L+IBA2mg/L愈傷組織誘導培養基上，培養條件為暗室培養，溫度25℃，濕度50%～60%，將誘導出來的愈傷組織接入液體培養基MS+NAA0.2mg/L+?2，4-D0.7mg/L上進行懸浮細胞培養30天，待懸浮細胞生長穩定，在培養基中附加前體物誘導子檸檬酸進行枳椇懸浮細胞的調控，取培養出來的枳椇懸浮細胞使用微波提取方法提取黃酮，采用HPLC法檢測黃酮的含量，黃酮含量2.905?%。

實施例2

選用枳椇幼嫩的葉片，用洗潔精浸泡三分鐘，自來水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用0.1％的升汞消毒9分鐘，無菌水沖洗?4-5?次。接種在MS+NAA0.3?mg/L+IBA3mg/L愈傷組織誘導培養基上，培養條件為暗室培養，溫度25℃，濕度50%～60%，將誘導出來的愈傷組織接入液體培養基MS+NAA0.3mg/L+?2，4-D1mg/L上進行懸浮細胞培養30天，待懸浮細胞生長穩定，在培養基中附加前體物誘導子檸檬酸進行枳椇懸浮細胞的調控，取培養出來的枳椇懸浮細胞使用微波提取方法提取黃酮，采用HPLC法檢測黃酮的含量，黃酮含量2.932?%。

實施例3

選用枳椇幼嫩的葉片，用洗潔精浸泡三分鐘，自來水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用0.1％的升汞消毒9分鐘，無菌水沖洗?4-5?次。接種在MS+NAA0.3mg/L+IBA4mg/L愈傷組織誘導培養基上，培養條件為暗室培養，溫度25℃，濕度50%～60%，將誘導出來的愈傷組織接入液體培養基MS+NAA0.3mg/L+?2，4-D1mg/L上進行懸浮細胞培養30天，待懸浮細胞生長穩定，在培養基中附加前體物誘導子檸檬酸進行枳椇懸浮細胞的調控，取培養出來的枳椇懸浮細胞使用微波提取方法提取黃酮，采用HPLC法檢測黃酮的含量，黃酮含量3.157?%。

實施例4

選用枳椇幼嫩的葉片，用洗潔精浸泡三分鐘，自來水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用0.1％的升汞消毒9分鐘，無菌水沖洗?4-5?次。接種在MS+NAA0.2mg/L+IBA4mg/L愈傷組織誘導培養基上，培養條件為暗室培養，溫度25℃，濕度50%～60%，將誘導出來的愈傷組織接入液體培養基MS+NAA0.2mg/L+?2，4-D0.3mg/L上進行懸浮細胞培養30天，待懸浮細胞生長穩定，在培養基中附加前體物誘導子檸檬酸進行枳椇懸浮細胞的調控，取培養出來的枳椇懸浮細胞使用微波提取方法提取黃酮，采用HPLC法檢測黃酮的含量，黃酮含量3.468?%。