[發明專利]一種可用于結核感染診斷的結核分枝桿菌重組抗原的制備

有效

• 申請號: 201310422989.0
• 申請日: 2013-09-16
• 公開（公告）號: CN103525829A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 王宏偉;高千;張俠;蘇忠蘭;易龍;丁一冰;田曼
• 申請（專利權）人: 南京大學(蘇州)高新技術研究院
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N15/10;C07K14/35;C12Q1/68;C12Q1/04;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 李紅團

技術領域

本發明提供了一種結核分枝桿菌重組抗原及其制備方法，本發明還提供了一種結核分枝桿菌的診斷試劑盒，能特異性地檢測結核分枝桿菌感染，涉及基因工程技術和免疫診斷技術。

背景技術

結核病目前依舊是21世紀嚴重危及人類健康的疾病,其中移民、HIV感染和耐藥是21世紀全球結核病控制所面臨的三大難題。據世界衛生組織（WHO）估計,目前全球已有20億人感染結核分枝桿菌（MTB），平均每1秒鐘就有1個新感染者出現,每年新發結核病人達800萬～1000萬，300萬人死于結核病，是死亡率最高的感染性疾病。全世界95％以上的結核病人在發展中國家，我國是全球結核病負擔最嚴重的22個國家之一，新發病例占全球的16％，結核病患者的人數居世界第二位，有近半數人口（5.5億）感染結核菌，包括活動性結核病人450萬人，占全球病人總數的1/4，每年13萬人死于結核感染。近些年來，雖然我國在結核防治方面取得了一定的成績，但目前我國傳染性肺結核的患病率仍居高不下，因此，我國已將結核病列為重點控制的重大疾病之一。

提高結核感染的診斷方法，對于防控結核病，具有重要意義。目前針對結核感染的傳統診斷方法，主要包括抗酸染色法、分離培養法、結核的血清學診斷、結核菌素的皮膚接種實驗以及結核抗原誘導的干擾素釋放實驗等。其中，抗酸染色法主要根據結核分枝桿菌的細胞壁中具有大量的脂質成份，容易被石炭酸復紅染液染成紅色，該染色雖然具有一定的特異性，但敏感性較差，據統計，40～60%的肺結核患者以及75%的肺外結核患者，其結核分枝桿菌的抗酸染色結果顯示為假陰性，因此很難滿足臨床要求。結核菌的分離培養法是將痰液、支氣管灌洗液、胸腹腔積液等在特定的培養基（如改良羅式培養基）中培養，可以較為特異性地鑒別結核分枝桿菌，但該方法耗時較長，一般需4～8周的時間，往往會造成病情的延誤，此外，該方法無法用于檢測菌陰性肺結核，因此使用起來也具有很大局限性。結核菌素皮膚試驗（PPD），其基本原理是通檢測感染者對結核菌素皮內接種所引起的遲發型變態反應（IV型超敏反應），反應越強，表示結核感染可能性越大，但由于PPD中含有許多分枝桿菌（包括致病性分枝桿菌、環境中非致病性分枝桿菌和卡介苗）共同的抗原，PPD皮試陽性并不能鑒別是因為結核分枝桿菌復合群感染，還是接觸環境中非結核分枝桿菌或卡介苗接種后造成的致敏。因此，PPD皮試診斷結核病的特異性差，用該方法進行結核病流行病學抽樣調查獲得的結核菌感染率是不準確的，并不能真正反映人群中結核菌感染的實際狀況。

結核感染的血清學檢測是通過測定結核抗原特異性的IgG、IgM及IgA抗體發展起來的免疫學診斷方法，該方法簡便易行，快速又無需特殊精密儀器，不但可以用于診斷肺結核，也可用于肺外結核感染的診斷，對于結核感染的初篩及鑒定具有重要意義。但是目前，結核血清學檢測技術中存在的主要問題是如何結核特異性抗原的選擇和使用，目前常用的抗原成份主要包括LAM抗原、A60、38kD、14KD、TBGL抗原、Ag85、早期分泌抗原ESAT6和組織培養離析蛋白CFP‐10等；但是，在結核血清學診斷過程中，使用上述單一抗原成份所取得的檢測結果并不理想，使用多種“雞尾酒”抗原診斷，則有助于提高結核血清學診斷的特異性和敏感性；此外，選擇結核分枝桿菌特異性的抗原成份，以排除環境中非致病性分枝桿菌和卡介苗交叉抗原的污染，也有利用于進一步提高血清學診斷的敏感性和特異性。結核特異性抗原誘導的干擾素釋放實驗（IGRA），是國際上近年來發展起來的針對結核菌特異性的T淋巴細胞的一種檢測手段，主要的原理是通過體外分離PBMC，經結核分枝桿菌特異性抗原刺激，通過檢測淋巴細胞釋放IFN‐γ　的水平，從而判定機體是否受到結核分枝桿菌的感染，該方法對于菌陰性結核、肺外結核以及隱性結核的感染，具有重要的診斷意義。目前國際上新發展起來的結核桿菌感染的體外篩選技術，主要使用了這一技術原理。其中分別包括來自英國的T.SPOT.TB系統和來自于澳大利亞的QuaitiFERON‐TB?Gold系統，兩種技術主要使用了兩種結核相關抗原，ESAT6抗原和CFP‐10抗原，其檢測敏感性分別為88%和76%，以上述兩種抗原為基礎發展結核的體外診斷技術，雖然具有較好的應用前景，但如需進一步提高結核感染的診斷效率，還依賴于獲得新的、更為特異性的結核分枝桿菌的抗原成份。