[發明專利]一種篩選間變性淋巴瘤激酶抑制劑高通量篩選方法

在審

• 申請號: 201310421283.2
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN104458677A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 嚴明;張陸勇;胡潔;高鵬
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于藥理學領域，利用均相時間分辨熒光檢測技術，構建了間變性淋巴瘤激酶(ALK)激酶抑制劑的高通量篩選模型，用于待測樣品對ALK激酶抑制活性的高通量檢測。

背景技術

ALK是一個受體型蛋白酪氨酸磷酸激酶，它能夠接受細胞外的信號，調控著細胞的生長、分化、存活和轉化。在結構上，ALK包括一個細胞外的配體結合區，一個跨膜區和細胞內的結構域。ALK的cDNA全長6226bp，編碼了一個177kDa的蛋白質，經過編譯后修飾的ALK蛋白質分子量接近200～220kDa。ALK是一個單鏈跨膜蛋白質，含有1620個氨基酸殘基。ALK的細胞膜外部分包含1030個氨基酸殘基，形成了幾個重要的結構。跨膜區包括28個氨基酸殘基，緊接著是一個由66個氨基酸殘基組成的關節膜片段。最初，人們是在間變性大細胞淋巴瘤中以一種激活的融合癌基因的形式發現了ALK，隨后連續的研究在多種癌癥中發現了ALK的融合形式，其中包括系統性組織異常增生、炎性肌纖維細胞瘤、非小細胞肺癌等。ALK在多種癌癥中的突變和異常的活性，已經使它成為一個治療ALK陽性癌癥的藥物靶點。因此，研究ALK激酶抑制劑具有重大意義。

時間分辨熒光技術(time-resolved?fluorescence，TRF)是基于鑭系元素如銪(Eu)、釤(Sm)、鏑(Dy)等具有較長熒光壽命的特點發展而來的。當銪螯合物供體與受體之間距離小于10nm，且供體發射光譜與受體激發光譜有重疊時，則發生熒光共振能量轉移，均相時間分辨熒光(homogeneous?time-resolved?fluorescence，HTRF)技術是法國Cisbio公司利用這一原理進行深入開發的產品。大多數熒光物質的熒光壽命非常短(一般為幾毫秒)，為了避免短暫的熒光干擾，Cisbio公司利用較長熒光壽命的鑭系螯合物作為熒光能量供體，受體經過別藻藍蛋白(allophycocyanin)或熒光素修飾，供體在能量轉移時就可以使受體也具有較長的熒光壽命。因此，能量轉移時受體發射光消失時間與供體發射光消失時間成正比，而與供受體間的距離成反比，這種方法延長了熒光檢測時間，降低了短暫熒光引起的背景干擾。

目前，已有多種ALK激酶抑制劑的篩選方法，多利用ELISA法來篩選ALK激酶抑制劑，但是此方法費時費力，難以做到高通量篩選。因此，建立方便快捷準確的檢測方法，特別是體外的功能性檢測在藥物篩選中越來越受到重視。

發明內容

本發明的目的在于建立一種基于均相時間分辨熒光的ALK激酶抑制劑高通量篩選模型，具有信噪比高，使用安全，樣品消耗量小的特點。

本發明的技術方案：采用均相時間分辨熒光方法建立體外ALK激酶抑制劑高通量篩選模型，初篩，復篩發現一類具有抑制ALK激酶活性的候選化合物。具體步驟如下：

本發明利用均相時間分辨熒光的方法建立了一種ALK激酶抑制劑高通量篩選模型。

步驟一：ALK激酶抑制劑篩選模型的建立與優化。

步驟二：陽性藥驗證模型可靠性。

步驟三：高通量篩選模型驗證。

附圖說明：

圖1：ALK激酶濃度梯度優化實驗結果。(n=3，)

圖2：ALK激酶溫孵時間優化實驗結果。(n=3，)

圖3：ALK激酶底物濃度優化實驗結果。(n=3，)

圖4：ALK激酶ATP濃度優化實驗結果。(n=3，)

圖5：陽性藥十字孢堿對ALK激酶的抑制曲線圖。(n=3，)

圖6：ALK激酶抑制劑高通量篩選模型信號檢測窗口。

圖7：高通量篩選Z′值分布。

具體實施方式

以下結合附圖說明本發明的具體實施方式：

1.ALK激酶抑制劑篩選方法建立

(1)實驗材料

ALK激酶檢測試劑盒(Cisbio，法國)、ALK激酶(Invitrogen，美國)、ATP(生興，中國)、十字孢堿(碧云天，中國)、384低體積白板(Coming，美國)、槍頭(Axygen，美國)。

(2)實驗步驟

1)進行ALK激酶濃度梯度、溫孵時間、底物濃度、ATP濃度實驗，見圖1-4。

2)待測化合物精確稱量，加入DMSO溶劑成母液，然后使用檢測緩沖液配制待測化合物溶液至所需濃度，初篩濃度約為1×10^-3mol/L。

3)在反應容器中每孔加入ALK激酶溶液2μl，底物溶液2μl，緩沖液或待篩化合物4μl，ATP2μl。室溫反應1小時。